ADMA (DimetilArginina asimmetrica) sierica e/o plasmatica in Fluorimetria Cod. Z58010

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1 ADMA (DimetilArginina asimmetrica) sierica e/o plasmatica in Fluorimetria Cod. Z58010 INTRODUZIONE L Ossido Nitrico (NO) endoteliale gioca un ruolo molto importante nella regolazione della pressione sanguigna e nella aggregazione piastrinica; è sintetizzato per stereospecifica ossidazione del gruppo N- terminale del residuo guanidinico dell Arginina. L ADMA (N G,N G,Dimetil-L-Arginina Asimmetrica), è un inibitore endogeno dell Ossido Nitrico sintetasi endoteliale (NOS), riducendo la produzione di NO. Livelli elevati di ADMA sono stati indicati come cause di disfunzione endoteliale, ipertensione, dislipidemia, iperglicemia, iperomocisteinemia, diabete mellito e malattie renali. L ADMA viene analizzata in Cromatografia Liquida ad Alte Prestazioni dopo purificazione del plasma e derivatizzazione. (ADMA) (SDMA) EUREKA srl LAB DIVISION VAT N Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N 008 ADMA sierica e/o plasmatica in Fluorimetria Febbraio

2 CARATTERISTICHE DEL KIT Principio del Metodo : Il presente metodo consente di analizzare la DimetilArginina Asimmetrica con procedura di Clean-up e successiva derivatizzazione per analisi in Fluorimetria. Con questo metodo è possibile determinare anche i picchi dell Arginina e della DimetilArginina Simmetrica. Dopo derivatizzazione, 100 µl della soluzione vengono iniettati nel sistema HPLC e letti in fluorimetria. Recupero del Metodo : > 98 % Sensibilità del Metodo : < 0,05 µmol/l ADMA Linearità del Metodo : > 16,00 µmol/l ADMA Valori di Normalità nel Plasma: 0,369 µmol/l ADMA Contenuto della Confezione : Rif. Clinical Chemistry Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili 3 anni a 2-8 C. Reagente A Soluzione di Condizionamento 1, 1 x 100 ml Reagente B Soluzione di Condizionamento 2, 1 x 100 ml Reagente C Soluzione di Condizionamento 3, 1 x 100 ml Reagente D Soluzione Diluente, 1 x 100 ml Reagente E Soluzione di Lavaggio 1, 1 x 100 ml Reagente F Soluzione di Lavaggio 2, 1 x 100 ml Reagente I Soluzione di Eluizione, 1 x 100 ml Reagente J Soluzione Starter 1 x 5 ml Reagente L Soluzione Derivatizzante, 1 x 4,6 mg Reagente N Soluzione Buffer 1, 1 x 20 ml (da ricostituire con 5 ml di Acetonitrile non fornito nel kit) Reagente O Soluzione Buffer 2, 1 x 15 ml Reagente M Fase Mobile, 8 x 500 ml Reagente P Soluzione test ADMA, 1 x 5 ml Reagente Q Soluzione test SDMA, 1 x 5 ml Reagente R Soluzione test Arginina, 1 x 5 ml Reagente S Calibratore liofilo plasmatico, 1 x 5 ml Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Vedi Avvertenze Colonne di Clean-up 100 pz Modalità di esecuzione del prelievo ematico e conservazione del Campione plasmatico: Prelevare circa 2 ml di Plasma in Eparina. Se non si analizza subito, stoccare il campione in congelatore a 20 C dove è stabile circa 1 mese. 2

3 PROCEDURA PREANALITICA FASE 1: In una provetta di vetro o plastica da 1,5 ml con tappo di chiusura pipettare: 200 µl di Soluzione test (Reag. P,Q o R) 200 µl di Reagente N Soluzione Buffer µl di Reagente O Soluzione Buffer 2 30 µl di Reagente J Sol. Starter 30 µl di Reagente L Sol. Derivatizzante (dopo ricostituzione) Agitare al vortex per 5 secondi FASE 2: Incubare a 20 C (Temperatura ambiente) per 30 minuti FASE 3: Aggiungere 150 µl di Acqua di grado HPLC Agitare al vortex per 5 secondi INIEZIONE : Iniettare 100 µl della soluzione nel sistema HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Verificare che la Sol. Test abbia tempi di ritenzione simili a quelli riportati in fig. 1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Importante : Questo Test non deve essere usato come calibratore CONDIZIONAMENTO E ATTIVAZIONE DELLE COLONNE DI CLEAN-UP Porre le colonne di Clean-up in provette di plastica da 10 ml in modo da raccogliere gli eluati da scartare. 1 Versare nelle colonne Clean-up 1,0 ml di Reagente A Soluzione di Condizionamento 1 Scartare l eluato 2 Versare nelle colonne Clean-up 1,0 ml di Reagente B Soluzione di Condizionamento 2 Scartare l eluato 3 Versare nelle colonne Clean-up 1,0 ml di Reagente C Soluzione di Condizionamento 3 Scartare l eluato PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Preparazione dei Campioni e del Calibratore In una provetta di plastica da 10 ml diluire il Calibratore e i Campioni secondo il seguente schema: Calibratore Campione Reagente D Soluzione Diluente 1000 µl 1000 µl Reagente S Calibratore liofilo plasmatico 400 µl / Campione / 400 µl Al vortex per 5 secondi Release N 008 ADMA sierica e/o plasmatica in Fluorimetria Febbraio

4 FASE 2 : Caricamento del Calibratore e dei Campioni nelle colonne di Clean-up. Pipettare (l operazione richiede 2 pipettate poiché la colonna Clean-up è da 1 ml) 1,4 ml del Calibratore e dei campioni precedentemente preparati nelle rispettive colonne di Clean-up. Lasciar percolare lentamente al flusso di circa 1,0 ml/minuto tutto il liquido di ogni Colonna Clean-up, anche con l'ausilio di un vuoto moderato. Gettare il liquido percolato FASE 3 : Pulizia dei campioni caricati nelle colonne Clean-up Pipettare nelle colonne Clean-up in sequenza: 1,0 ml di Reagente E Sol. di lavaggio 1 Gettare il liquido percolato 1,0 ml di Reagente F Sol. di lavaggio 2 Gettare il liquido percolato e portare a secco! FASE 4 : Eluizione dalle colonne Clean-up Porre le colonne Clean-up in provette di raccolta pulite. Pipettare nelle colonne Clean-up: 1,0 ml di Reagente I Sol. eluente e raccogliere l'eluato. Avvertenza! Eluire lentamente per circa 1 minuto! Agitare l eluato al vortex per 5 secondi FASE 5 : Procedura di derivatizzazione Pipettare in una vial o in una provetta di vetro da 1,5 ml con tappo di chiusura : 200 µl di ELUATO proveniente dalla procedura di purificazione 200 µl di Reagente N Soluzione Buffer µl di Reagente O Soluzione Buffer 2 30 µl di Reagente J Sol. Starter 30 µl di Reagente L Sol. Derivatizzante (dopo ricostituzione) Agitare al vortex per 5 secondi FASE 6 : Incubare a 20 C (Temperatura ambiente) per 30 minuti FASE 7 : Aggiungere 150 µl di Acqua di grado HPLC Agitare al vortex per 5 secondi N.B.: il campione così preparato è stabile 24 h a 2-8 C INIEZIONE : Iniettare 100 µl della soluzione derivatizzata nell HPLC e attendere la stampa del cromatogramma. Per determinare l Arginina è necessario diluire il campione dopo la FASE 7 almeno 1:20 con Acqua di grado HPLC prima di iniettare 100 µl nel sistema cromatografico. Release N 008 ADMA sierica e/o plasmatica in Fluorimetria Febbraio

5 REAGENTE P : Soluzione test ADMA ADMA sierica e/o plasmatica - Avvertenze ADMA circa 5 µmol/l REAGENTE Q : Soluzione test SDMA SDMA circa 5 µmol/l REAGENTE R : Soluzione test ARGININA ARGININA circa 5 µmol/l REAGENTE S : CALIBRATORE PLASMATICO LIOFILO Lotto n 001 ADMA SDMA ARGININA Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema HPLC. Aggiungere esattamente 5 ml di H 2 O di grado HPLC e agitare delicatamente per 15 minuti fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Conservazione e stabilità : i Calibratori liofili sono stabili 36 mesi dalla data di preparazione se conservati a 2-8 C. Almeno 7 giorni se conservati a 2 8 C e 2 mesi a 20 C una volta ricostituiti. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 1 x 5 ml Precauzioni : questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. 4,78 µmol/l 4,52 µmol/l 80 µmol/l PARAMETRI DEL DETECTOR FLUORIMETRICO λ DI ECCITAZIONE λ di EMISSIONE VOLTAGGIO TEMPO DI INTEGRAZIONE 420 nm 483 nm Medium 5 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Fenile SPHERISORB 250 mm x 4,6 mm, 5 µ, è tassativo l uso della Guard Column Cartridge Holder/CARTUCCIA PRECOLONNA, cod. ZPSS e dei PREFILTRI per CARTUCCIA PRECOLONNA (1 x 10 pz.) cod. ZPSS CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Fenile (SPHERISORB 250 mm x 4,6 mm, 5 µ) e far passare 30 ml di una soluzione di Acqua : Acetonitrile (50:50 v/v) grado HPLC, al flusso di 1,0 ml/min. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di 1,0 ml/min e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di fase. Al termine, iniettare il test derivatizzato e verificare la congruità della separazione. NON è consigliato lavorare a ricircolo di fase. PULIZIA DELLA COLONNA Alla fine della seduta di analisi far flussare 30 ml di H 2 O grado HPLC e scaricare. Far flussare una soluzione Acqua : Acetonitrile (40:60 v/v) grado HPLC per 30 minuti scaricandola. La colonna è di nuovo pronta per la successiva seduta di analisi. PARAMETRI HPLC LOOP 100 µl Flusso di lavoro consigliato 1,0 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 120 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 3394 / 3395 / 3396 ATTENUAZIONE 3 o 4 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE 5

6 ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z Calibratore liofilo plasmatico per ADMA, SDMA, Arginina 4 x 5 ml Z Controllo liofilo plasmatico per ADMA, SDMA, Arginina, Livello 1 5 x 5 ml Z Controllo liofilo plasmatico per ADMA, SDMA, Arginina, Livello 2 5 x 5 ml Z Controllo liofilo plasmatico per ADMA, SDMA, Arginina, Livelli 1 e 2 2 x 5 x 5 ml ZPSS Colonna Analitica Phenil Spherisorb (250 x 4,6mm -5 um) 1 PZ ZPSS In Line Guard Cart Holder kit 1 PZ ZPSS Prefiltri Fenilici Spher (4,6 mm x 1 cm 5 µ) Guard 1 x 3 PZ S Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 144 PZ 6

7 ADMA sierica e/o plasmatica ( Cromatogrammi di Riferimento) Fig. 1 Soluzione Test Fig. 2 Standard di Calibrazione R.T ADMA R.T ADMA 5,0 µmol/l 7

8 ADMA sierica e/o plasmatica ( Cromatogrammi di Riferimento) Fig. 3 Standard di Calibrazione Fig. 4 Campione plasmatico arricchito R.T ADMA 1,0 µmol/l R.T ADMA 1,38 µmol/l 8

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