ANTIRETROVIRALI 1 SIERICI IN UV - FAST Codice Z67010 (Atazanavir, Ritonavir, Efavirenz e Lopinavir)

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1 ANTIRETROVIRALI 1 SIERICI IN UV - FAST Codice Z67010 (Atazanavir, Ritonavir, Efavirenz e Lopinavir) INTRODUZIONE Dal 1981, quando l'aids è stato per la prima volta riconosciuto, sono stati approvati una ventina di farmaci per il trattamento dell'infezione da HIV, un retrovirus, da cui la denominazione di Farmaci Antiretrovirali. Da allora numerosi altri farmaci sono stati sintetizzati e messi in commercio. I farmaci antiretrovirali non sono curativi, possono impedire la replicazione dell'hiv o il suo ingresso nella cellula ospite, ma non sono in grado di eliminare il virus dall'organismo. Poiché il virus HIV può diventare resistente ai farmaci, il trattamento dell'infezione da HIV consiste in una combinazione di farmaci antiretrovirali. I farmaci antiretrovirali si suddividono in 3 classi: inibitori della trascrittasi inversa, inibitori della proteasi ed inibitori della fusione. ATAZANAVIR, nome commerciale Reyataz, e RITONAVIR, nome commerciale Norvir, sono inibitori della proteasi, cioè interferiscono con l'enzima proteasi che il virus HIV utilizza per produrre particelle virali infettive. Associato a una piccola dose di Ritonavir, Atazanavir è indicato in combinazione con altri agenti antiretrovirali per il trattamento dei pazienti sieropositivi già precedentemente trattati. Questi pazienti possono così finalmente beneficiare di una terapia contenente un inibitore della proteasi senza più dover assumere un elevato numero di pillole nella giornata. Atazanavir in associazione a Ritonavir ha dimostrato nei pazienti pretrattati un efficacia antivirale paragonabile a quella di un regime contenente Lopinavir/Ritonavir, finora ritenuto il trattamento di riferimento per questi pazienti. Inoltre, rispetto alla terapia standard, Atazanavir/Ritonavir ha mostrato un profilo lipidico più favorevole e ha determinato una minore incidenza di diarrea. E se gli studi per l approvazione europea di Atazanavir hanno coinvolto oltre pazienti HIV positivi, negli Stati Uniti - dove il farmaco è disponibile da giugno 2003 sono ad oggi quasi 30 mila i pazienti che hanno utilizzato Atazanavir come parte di un regime di combinazione. Il presente metodo consente di analizzare le seguenti molecole: Atazanavir, Ritonavir, Efavirenz, Lopinavir. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N 010 Antiretrovirali 1 sierici in UV - FAST Settembre

2 CARATTERISTICHE DEL KIT Principio del Metodo: Il presente metodo consente di determinare gli Antiretrovirali dopo purificazione su colonne Clean-up ed estrazione con un opportuno reagente. La soluzione viene poi iniettata in HPLC. Recupero del Metodo : 100% Sensibilità del Metodo : 20 µg/l Range dinamico del metodo : µg/l Range terapeutico nel siero : Ritonavir ng/ml Atazanavir ng/ml Efavirenz ng/ml Lopinavir ng/ml Contenuto della confezione : Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a temperatura ambiente ( < 20 C) Reagente A Soluzione Stabilizzante, 1 x 90 ml Reagente B Soluzione di Condizionamento 1, 1 x 100 ml Reagente C Soluzione di Condizionamento 2, 1 x 100 ml Reagente D Soluzione di Lavaggio 1, 1 x 100 ml Reagente E Soluzione di Lavaggio 2, 1 x 100 ml Reagente F Soluzione di Eluizione, 1 x 90 ml Reagente G Soluzione Test, 1 x 5 ml Reagente H Soluzione Standard Interno, 1 x 5 ml Reagente I Calibratore liofilo sierico, 2 x 5 ml Vedi Avvertenze Stoccare a 2-8 C Vedi Avvertenze Reagente M Fase Mobile, 11 x 500 ml Colonne Clean-up 100 pz Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Strumento HPLC isocratico con loop da 100 µl. Detector spettrofotometrico UV λ=203 nm Registratore di cromatogrammi Autocampionatore. Computer gestionale Modalità per il prelievo ematico : Siero: Prelevare 3 ml di sangue venoso in una provetta senza gel. Centrifugare a 4000 rpm per 5 minuti. Separare il siero e stoccarlo a 20 C. Stabile 1 settimana. 2

3 PROCEDURA PREANALITICA Preparazione della Soluzione Test a circa µg/l In una provetta pipettare: 300 µl di Reagente F Sol. di Eluizione 500 µl di H 2 O di grado HPLC 100 µl di Reagente G Sol. Test 100 µl di Reagente H Sol. Standard Interno INIEZIONE : Al vortex per 30 secondi Iniettare 100 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma. Verificare che la Sol. Test abbia un tempo di ritenzione simile a quello riportato in fig. 1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Importante : Questa Soluzione così ottenuta non deve essere usata come calibratore PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Condizionamento delle colonne Clean-up Versare in colonna 1 ml di Reagente B Soluzione Condizionamento 1 Scartare l eluato Versare in colonna 1 ml di Reagente C Soluzione Condizionamento 2 Scartare l eluato FASE 2 : Preparazione del Calibratore, dei Campioni e degli eventuali Controlli Dispensare in provetta : Calibratore Controllo Campione Reagente I Calibratore sierico liofilo 1000 µl Controllo 1000 µl Campione 1000 µl Reagente A Soluzione Stabilizzante 900 µl 900 µl 900 µl Reagente H Standard Interno 100 µl 100 µl 100 µl Al vortex per 20 secondi FASE 3 : Caricamento del Calibratore, dei Controlli e dei Campioni nelle colonne Clean-up Pipettare nelle rispettive colonne Clean-up il Calibratore, i Controlli ed i Campioni precedentemente preparati, mediante due aggiunte successive da 1 ml ognuna. Lasciar percolare lentamente al flusso di circa 1,0 ml/minuto tutto il liquido di ogni Colonna Clean-up, anche con l'ausilio di un vuoto moderato. Release N 010 Antiretrovirali 1 sierici in UV - FAST Settembre

4 FASE 4 : Lavaggio delle colonne Clean-up: Lavare con 1 ml di Reagente D Soluzione di Lavaggio 1 Scartare l eluato e portare a secco con un leggero flusso d aria Lavare con 1 ml di Reagente E Soluzione di Lavaggio 2 Scartare l eluato e portare a secco con un leggero flusso d aria FASE 5 : Eluizione: Eluire con 700 µl di Reagente F Soluzione di Eluizione Eluire lentamente. Raccogliere l eluato ed agitare al vortex FASE 6 : Aggiungere 500 µl di H 2 O di grado HPLC. Al vortex per 20 secondi N.B.: il campione così preparato è stabile 7 giorni a 2-8 C INIEZIONE : Iniettare 100 µl della soluzione nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma Release N 010 Antiretrovirali 1 sierici in UV - FAST Settembre

5 REAGENTE F : SOLUZIONE TEST ANTIRETROVIRALI 1 SIERICI FAST - Avvertenze ATAZANAVIR RITONAVIR LOPINAVIR EFAVIRENZ Circa µg/l Circa µg/l Circa µg/l Circa µg/l REAGENTE G: CALIBRATORE SIERICO LIOFILO Lot ATAZANAVIR RITONAVIR LOPINAVIR EFAVIRENZ Modalità d uso e ricostituzione: i calibratori devono essere usati per calibrare il sistema HPLC. Aggiungere 5 ml di H 2 O di grado HPLC e agitare delicatamente fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: I calibratori liofili sono stabili 36 mesi se conservati a 20 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 2 8 C e 1 mese a -20 C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento: 2 x 5 ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo µg/l 1000 µg/l 3000 µg/l 2000 µg/l PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO λ GAIN TEMPO DI INTEGRAZIONE 203 nm 0,001 AUFS 10 secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare il sistema completo PURSUIT XRs C18 (50 x 4,6 mm, 3 µ) è tassativo l uso del Metasaver Precolumn Filter 0.5 um (1 x 10 pz), cod. ZA6005. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase PURSUIT XRs C18 (50 x 4,6 mm - 3 µm). Disconnettere il detector e far passare 30 ml di una soluzione di H 2 O : Metanolo ( 20 : 80 v/v ) e successivamente 30 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di 1,5 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Filtrare la fase mobile con pompa da vuoto e filtro idoneo da 0,22 µ o 0,45 µ. Condizionare la colonna con la Fase Mobile al flusso di 1,5 ml/minuto e scaricare i primi 30 ml. Condizionare ulteriormente per 30 minuti anche a ricircolo di fase. NON è possibile effettuare analisi a ricircolo di fase mobile. Se la T Amb del Laboratorio è > 20 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Alla fine della seduta di analisi far flussare 30 ml di H 2 O e scaricare. Far flussare una soluzione di Acqua : Metanolo o Acetonitrile 20:80 (v/v) per 30 minuti scaricandola. La colonna è di nuovo pronta per la successiva seduta di analisi. LOOP 100 µl Flusso di lavoro consigliato 2,5 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 110 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 3394 / 3395 / 3396 ATTENUAZIONE 5 5

6 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z67016 Calibratore liofilo sierico per Antiretrovirali 1 4 x 5 ml Z67017 Controllo liofilo sierico per Antiretrovirali 1, Livello 1 5 x 5 ml Z67018 Controllo liofilo sierico per Antiretrovirali 1, Livello 2 5 x 5 ml Z67019 Controllo liofilo sierico per Antiretrovirali 1, Livelli 1 e 2 2 x 5 x 5 ml ZA C046 Sistema completo Colonna Analitica Pursuit XRs C18 (50 x 4,6mm -3 um) 1 PZ ZA R046 Colonna interna Pursuit XRs C18 1 PZ ZA6001CG3 Precolonna interna per Pursuit XRs C18 1 x 3 PZ ZA6005 Metasaver Precolumn Filter 0.5 um 1 x 10 PZ S29057U Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 100 PZ 6

7 ANTIRETROVIRALI 1 SIERICI FAST ( Cromatogrammi di Riferimento ) Fig. 1 : Soluzione test Fig. 2 : Calibratore sierico R.T Standard Interno R.T Standard Interno R.T Atazanavir R.T Atazanavir 1000 ng/ml R.T Efavirenz R.T Efavirenz 2000 ng/ml R.T Ritonavir R.T Ritonavir 1000 ng/ml R.T Lopinavir R.T Lopinavir 3000 ng/ml 7

8 ANTIRETROVIRALI 1 SIERICI FAST ( Cromatogrammi di Riferimento ) Fig. 3 : Controllo basso Fig. 4 : Controllo alto R.T Standard Interno R.T Standard Interno R.T Atazanavir 196 ng/ml R.T Atazanavir 3231 ng/ml R.T Efavirenz 998 ng/ml R.T Efavirenz 4231 ng/ml R.T Ritonavir 189 ng/ml R.T Ritonavir 3235 ng/ml R.T Lopinavir 2030 ng/ml R.T Lopinavir ng/ml 8