TOPIRAMATO PLASMATICO in FLUORIMETRIA Codice Z77010

Transcript

1 TOPIRAMATO PLASMATICO in FLUORIMETRIA Codice Z BIOCHIMICA Il topiramato è un monosaccaride sulfamato sostituito con alcuni meccanismi di azione che provocano il blocco dell insorgenza delle convulsioni: i principali sono la modulazione dei canali del sodio voltaggio-dipendenti, il potenziamento dell attività inibitoria del neurotrasmettitore GABA e l attenuazione della attività eccitatoria dei neurotrasmettitori AMPA-Kainato. Il profilo farmacocinetico del topiramato, rispetto a quello di altri farmaci antiepilettici, dimostra una lunga emivita plasmatica, proprietà farmacocinetiche lineari, escrezione prevalentemente per via renale, assenza di significativi legami con le proteine plasmatiche e mancanza di metaboliti attivi clinicamente rilevanti. Vi è una differenza tra sessi nel volume di distribuzione: i valori nelle femmine sono mediamente pari al % di quelli nei maschi. Questo viene attribuito alla maggiore presenza di grasso corporeo nelle femmine senza conseguenze cliniche. Il cibo non ha effetti clinici sulla biodisponibilità del topiramato. Interferenze: la contemporanea somministrazione di topiramato e fenitoina e/o carbamazepina comporta una diminuzione della concentrazione di topiramato. Il topiramato è approvato per l uso nell uomo sia negli adulti sia nei pazienti pediatrici per la sua attività a spettro relativamente ampio contro molti tipi di crisi convulsive e per gli effetti collaterali minimi. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 9/9/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N Topiramato plasmatico in Fluorimetria Giugno

2 Principio del Metodo : CARATTERISTICHE DEL KIT Il presente metodo consente di determinare le concentrazioni plasmatiche del Topiramato dopo purificazione SPE e derivatizzazione del plasma con un opportuno reagente; dopo una doppia incubazione a C il campione viene iniettato nel cromatografo HPLC. Recupero del Metodo : 9, % Sensibilità del Metodo : Range Dinamico : Valori di Riferimento: µg/l. µg/l.. µg/l CV%:, intra serie, inter serie Contenuto della confezione : Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili anni a C. Eccetto il Reagente G che va stoccato a C. Reagente A - Soluzione Diluente, x ml Reagente A Soluzione Diluente per Standard Interno, x ml Reagente B - Soluzione di Condizionamento, x ml Reagente C - Soluzione di Condizionamento, x ml Reagente D Soluzione di Lavaggio, x ml Reagente E - Soluzione di Lavaggio, x ml Reagente F Soluzione Eluente, x ml Reagente G Soluzione Standard Interno, x ml Stoccare a C Reagente H Soluzione Derivatizzante, x ml Reagente I Soluzione Stabilizzante, x ml Reagente L Soluzione Test, x ml Vedi Avvertenze Calibratore liofilo plasmatico, x ml Codice Z (confezionato a parte - vedi scheda tecnica) Reagente M - Fase Mobile, 9 x ml Colonne di Clean up, pz Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento HPLC isocratico con loop da o µl Detector Fluorimetrico λ EX = nm λ EM = nm Registratore di cromatogrammi Dotazione opzionale : Modalità di prelievo ematico : Autocampionatore Computer gestionale Prelevare ml di sangue venoso in una provetta con Eparina come anticoagulante per il plasma. Centrifugare a rpm per minuti. Separare il plasma e stoccarlo a C. Stabile settimane. E possibile utilizzare siero (senza gel) in alternativa al plasma con Eparina.

3 PROCEDURA PREANALITICA Preparazione dello Standard Interno Diluire il Reagente G Sol. Standard Interno : in Reagente A Sol. Diluente per Standard Interno preparando il volume sufficiente per coprire i campioni della seduta analitica Preparazione della Soluzione Test FASE : In una vial da ml inserire : N.B.: tale diluizione va preparata fresca ad ogni seduta analitica µl di Reagente H Soluzione Derivatizzante 9 µl di Acetonitrile (non fornito nel kit) µl di Sol.Standard Interno diluito come indicato precedentemente µl di Reagente L Soluzione Test Chiudere le vials con il tappo e vortexare per sec. FASE : Incubare per minuti a C FASE : Raffreddare ed aggiungere µl di Reagente I Soluzione Stabilizzante FASE : Incubare per minuti a C Chiudere le vials con il tappo e vortexare per sec. FASE : Raffreddare ed aggiungere µl di Acqua di grado HPLC Al vortex per secondi NOTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare - l di questa soluzione in HPLC per identificare il tempo di ritenzione del Topiramato che deve essere simile a quello riportato in fig.. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Importante : Questo Test così ottenuto non deve essere usato come calibratore Release N Topiramato plasmatico in Fluorimetria Giugno

4 PROCEDURA ANALITICA FASE : Preparazione dei Campioni, dello standard e dei controlli Dispensare in provetta : Calibratore Controllo Campione Calibratore µl Controllo µl Campione µl Reagente A Sol. Diluente µl µl µl Al vortex per almeno secondi FASE : Condizionamento delle colonne Clean-up. Preparare un numero di colonne Clean-up pari al numero dei campioni da analizzare più lo Standard di Calibrazione e gli eventuali Controlli. Versare in colonna ml di Reagente B Sol. di condizionamento Non portare a secco! Versare in colonna ml di Reagente C Sol. di condizionamento Non portare a secco! FASE : Caricamento del Campione Scartare l eluato Versare, ml di campione precedentemente preparato nelle colonne Clean-up e lasciar percolare tutto il liquido di ogni colonna Clean-up, anche con l ausilio di un vuoto moderato, alla velocità di circa ml/minuto ( goccia a goccia ). FASE : Lavaggio Lavare con ml di Reagente D Sol. di lavaggio Non portare a secco! Lavare con ml di Reagente E Sol. di lavaggio Portare a secco anche con l ausilio di un vuoto moderato Scartare l eluato FASE : Eluizione Eluire con, ml di Reagente F Sol. eluente Portare a secco anche con l ausilio di un vuoto moderato Al vortex per secondi N.B.: il campione così preparato è stabile settimane a - C Release N Topiramato plasmatico in Fluorimetria Giugno

5 Diluire il Reagente G Sol. Standard Interno : in Reagente A Sol. Diluente per Standard Interno preparando il volume sufficiente per coprire i campioni della seduta analitica FASE : In una vial da ml inserire : N.B.: tale diluizione va preparata fresca ad ogni seduta analitica µl di eluato ottenuto nella FASE µl di Sol.Standard Interno diluito come indicato precedentemente µl di Reagente H Soluzione Derivatizzante Chiudere le vials con il tappo e vortexare per sec. FASE : Incubare per minuti a C FASE : Raffreddare ed aggiungere µl di Reagente I Soluzione Stabilizzante Chiudere le vials con il tappo e vortexare per sec. FASE 9: Incubare per minuti a C FASE : Raffreddare ed aggiungere µl di Acqua di grado HPLC Al vortex per secondi INIEZIONE : N.B.: il campione così preparato è stabile giorni a - C Iniettare - µl della soluzione nel Cromatografo HPLC e attendere la stampa del cromatogramma. Release N Topiramato plasmatico in Fluorimetria Giugno

6 TOPIRAMATO - Avvertenze REAGENTE L : SOLUZIONE TEST TOPIRAMATO. µg/l PARAMETRI DEL DETECTOR FLUORIMETRICO λ Ex λ Em GAIN nm nm Low PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Hypersil Gold CN, x mm, µ, è tassativo l uso della protezione colonna Javelin Colfilter. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Hypersil Gold CN, x mm, µ. Disconnettere il detector e far passare ml di una soluzione di H O : Acetonitrile ( : v/v ) ad un flusso di ml/min. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di ml/minuto e scaricare i primi ml. NON è possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Se la temperatura amb. del Laboratorio è > C si consiglia di conservare a - C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA E DELL AGO DI INIEZIONE PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare per minuti H O a ml/min e scaricare. Flussare una soluzione di H O : Acetonitrile ( : v/v ) a ml/min per minuti scaricandola. La colonna va stoccata in una soluzione di H O : Acetonitrile ( : v/v ). L ago di iniezione va lavato con una soluzione di H O : Acetonitrile o Etanolo ( : v/v ). LOOP o µl Flusso di lavoro consigliato ml/minuto Pressione corrispondente Circa bar ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z Calibratore plasmatico per Topiramato x ml Z Controllo plasmatico per Topiramato Livello x ml Z Controllo plasmatico per Topiramato Livello x ml Z9 Controllo plasmatico per Topiramato Livelli e x x ml TF Colonna Analitica Hypersil Gold CN ( x,mm - um) PZ TF Javelin Colfilter - Superchrom x PZ S9U Vial standard di vetro da ml con tappo a vite x PZ

7 TOPIRAMATO PLASMATICO ( Cromatogrammi di Riferimento ).. 9. µv.. 9. µv TOPIRAMATO T O P I R A M A T O I S RT [min] T O P I R A M A T O I S RT [min] 9 9 Fig. Soluzione Test R.T.. Topiramato R.T.. Standard Interno Fig. Calibratore plasmatico R.T.. Topiramato. µg/l R.T..9 Standard Interno

8 TOPIRAMATO PLASMATICO ( Cromatogrammi di Riferimento ) µv T O P I R A M A T O I S RT [min] µv T O P I R A M A T O I S RT [min] 9 9 Fig. Controllo plasmatico livello R.T.. Topiramato. µg/l R.T.. Standard Interno Fig. Campione plasmatico R.T..9 Topiramato.9 µg/l R.T.. Standard Interno