LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert kit Ref. RTS096

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1 ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Offices: Tel Fax E. mail: WEB site: LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert kit Ref. RTS096 Composto da: Composed by: Composé par: Compuesto por: Composta por: Komponiert von: LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliPROBE Q - PCR Alert AmpliMASTER RTS096M RTS096P RTS000 RTS096_Front

2 LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliMIX SOMMARIO USO PREVISTO pag. 1 PRINCIPIO DEL SAGGIO pag. 2 DESCRIZIONE DEL PRODOTTO pag. 2 MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO pag. 2 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO pag. 2 ALTRI PRODOTTI RICHIESTI pag. 3 AVVERTENZE E PRECAUZIONI pag. 3 CAMPIONI E CONTROLLI pag. 4 PROCEDURA pag. 5 LIMITI DELLA PROCEDURA pag. 10 CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI pag. 11 BIBLIOGRAFIA pag. 14 PROBLEMI E SOLUZIONI pag. 15 LEGENDA DEI SIMBOLI pag. 16 USO PREVISTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com sito WEB: C Il prodotto è parte di un saggio qualitativo di amplificazione degli acidi nucleici per la ricerca del DNA di Legionella pneumophila (L. pneumophila) in campioni di DNA estratto da escreato, lavaggi bronco-alveolari (BAL), bronco-tracheo aspirati (BA). Il prodotto trova impiego, insieme ai dati clinici e ad altri esami di laboratorio, nella diagnosi e nel monitoraggio dell'infezione da L. pneumophila. PRINCIPIO DEL SAGGIO La procedura prevede l'esecuzione di una reazione di amplificazione real time in micropiastra con un termostato programmabile con sistema ottico di rilevamento della fluorescenza (thermal cycler per real time). In ogni pozzetto si effettua una reazione di amplificazione specifica per una regione del gene mip di L. pneumophila e per una regione del gene umano della beta Globina (Controllo Interno di idoneità del campione) utilizzando il DNA estratto dai campioni in esame. La sonda specifica per L. pneumophila marcata con il fluoroforo FAM è attivata quando ibrida con il prodotto specifico della reazione di amplificazione per L. pneumophila. La sonda specifica per il Controllo Interno marcata con il fluoroforo VIC è attivata quando ibrida con il prodotto della reazione di amplificazione per il Controllo Interno. L emissione della fluorescenza aumenta con l'aumentare dei prodotti specifici della reazione di amplificazione ed è misurata e registrata dallo strumento. L'elaborazione dei dati permette di determinare la presenza del DNA di L. pneumophila nel campione di partenza. La standardizzazione del sistema è stata eseguita su strumenti Applied Biosystems della serie DESCRIZIONE DEL PRODOTTO Il prodotto fornisce la miscela di oligonucleotidi di innesco AmpliMIX per l'amplificazione real time in una soluzione stabilizzante, prealiquotata in quattro provette monouso. Ogni provetta contiene 110 µl di soluzione, sufficiente per 24 reazioni. Gli oligonucleotidi di innesco per L. pneumophila sono specifici per una regione del gene mip di L. pneumophila. Gli oligonucleotidi di innesco per il Controllo Interno di idoneità del campione sono specifici per la regione promotore e 5' UTR del gene umano della beta Globina. Il prodotto consente di effettuare 96 determinazioni, controlli positivi e negativi compresi. MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO Componente Descrizione Quantità Composizione Etichettatura LEGIO. pn. AmpliMIX miscela di oligonucleotidi di innesco 4 x 110 µl Oligonucleotidi, TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerolo, Triton X-100 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO - Cappa a flusso laminare. - Guanti senza polvere monouso in lattice o simili. - Miscelatore vortex. - Microcentrifuga da banco ( RPM). - Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Acqua bidistillata sterile. - Termostato programmabile con sistema ottico di rilevamento della fluorescenza. - SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 1/16 SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 2/16

3 ALTRI PRODOTTI RICHIESTI I reagenti per l'estrazione del DNA dai campioni da analizzare, il controllo positivo di estrazione, i reagenti ottimizzati per l'amplificazione, i reagenti di rivelazione (sonde fluorescenti) e controllo positivo di amplificazione non sono inclusi in questo prodotto. Per eseguire queste fasi analitiche si consiglia l impiego dei seguenti prodotti accessori di ELITechGroup S.p.A.: «EXTRAcell» (codice EXTD02), kit di estrazione del DNA da campioni cellulari; il kit consente di effettuare 50 estrazioni. «CPE - DNA - Internal Control» (codice CTREXTG) o «CPE - Internal Control» (codice CTRCPE), controllo positivo di estrazione di DNA plasmidico per estrazioni del DNA da campioni non cellulari. «Q - PCR Alert AmpliMASTER» (codice RTS000), miscela di reagenti ottimizzati, micropiastre e fogli adesivi per l'amplificazione real time; il prodotto consente di effettuare 96 reazioni. «LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliPROBE» (codice RTS096-P), sonde fluorescenti per l'amplificazione real time; il prodotto consente di effettuare 96 reazioni. «LEGIONELLA pn. - Positive Control» (codice CTR096), controllo positivo di DNA plasmidico; il prodotto consente di effettuare 25 sessioni. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Questo prodotto è riservato esclusivamente all'uso in vitro. Avvertenze e precauzioni generali Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno 30 minuti oppure trattato in autoclave a 121 C per un' ora prima di essere smaltito. Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero potenzialmente infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere neutralizzati prima dell'eliminazione. Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi / la faccia. Non pipettare a bocca alcuna soluzione. Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro. Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti. Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti. Leggere tutte le istruzioni fornite nel prodotto prima di eseguire il saggio. Attenersi alle istruzioni fornite nel prodotto durante l'esecuzione del saggio. Rispettare la data di scadenza del prodotto. Utilizzare solo i reagenti presenti nel prodotto e quelli consigliati dal produttore. Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi. Non utilizzare reagenti provenienti da prodotti di altri produttori. Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici, richiedono personale addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni da parte di prodotti di amplificazione. E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai introdurre un prodotto di amplificazione nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai trasferire camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione all'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai essere aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso. Avvertenze e precauzioni specifiche per i componenti Le provette contenenti l'amplimix sono monouso e pertanto devono essere utilizzate una volta sola nella preparazione della miscela di reazione. L'AmpliMIX non presenta frasi di rischi (R) e presenta i seguenti consigli di prudenza (S): S Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi. CAMPIONI E CONTROLLI Campioni Questo prodotto deve essere utilizzato con DNA estratto dai seguenti campioni biologici: escreato, lavaggi bronco-alveolari (BAL), bronco-tracheo aspirati (BA). I campioni di escreato, di lavaggio bronco-alveolare e di bronco-tracheo aspirato destinati all estrazione del DNA devono essere raccolti secondo le indicazioni del laboratorio in Soluzione fisiologica sterile, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di tre giorni. Non congelare i campioni di escreato, di lavaggio bronco-alveolare e di bronco-tracheo aspirato in modo da evitare la lisi delle cellule e la perdita di titolo del DNA batterico. Le istruzioni per il pretrattamento del campione clinico e per l'estrazione del DNA sono contenute nel Manuale di istruzioni per l'uso del kit «EXTRAcell». Sostanze interferenti Il DNA estratto dal campione di partenza non deve contenere emoglobina e mucoproteine per evitare fenomeni di inibizione e la comparsa di frequenti risultati non validi. Non sono disponibili dati riguardo eventuali fenomeni di inibizione da parte di farmaci antivirali, antibiotici, chemioterapici o immunosopressori. Controlli di amplificazione E' assolutamente necessario convalidare ciascuna sessione di amplificazione allestendo una reazione di controllo negativo e una reazione di controllo positivo. Per il controllo negativo utilizzare acqua bidistillata sterile (non fornita nel prodotto) da aggiungere alla reazione al posto del DNA estratto dal campione. Per il controllo positivo utilizzare il prodotto «LEGIONELLA pn. - Positive Control». Controlli di qualità E' consigliato convalidare l'intera procedura di analisi di ciascuna sessione, estrazione ed amplificazione, utilizzando un campione negativo e un campione positivo già testati o del materiale di riferimento calibrato. SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 3/16 SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 4/16

4 PROCEDURA Impostazione della sessione di amplificazione real time (Da eseguire nell'area di amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione) Prima di iniziare la sessione, riferendosi alla documentazione dello strumento, è necessario: - accendere il thermal cycler per real time, accendere il computer di controllo, lanciare il software dedicato e aprire una sessione "absolute quantification"; - impostare il "detector" per la sonda per L. pneumophila con il "reporter" = "FAM" e il "quencher" = "none" (NFQ è un quencher non fluorescente) e chiamarlo LEGIO.PN. ; - impostare il "detector" per la sonda per la beta Globina con il "reporter" = "VIC" e il "quencher" = "none" (NFQ è un quencher non fluorescente) e chiamarlo CI ; - per ciascun pozzetto in uso della micropiastra, impostare i "detector" (tipo di fluorescenza da misurare), il "passive reference" = "ROX" (normalizzazione della fluorescenza misurata) e il tipo di reazione (campione, controllo negativo di amplificazione, controllo positivo di amplificazione). Compilare il Piano di lavoro allegato al fondo di questo manuale di istruzioni per l'uso trascrivendo queste informazioni oppure stampare l'organizzazione della micropiastra. Il Piano di lavoro dovrà essere seguito con attenzione durante il trasferimento nei pozzetti della miscela di reazione e dei campioni. Si illustra sotto, a titolo di esempio, come può essere organizzata l'analisi di 14 campioni. C1 C9 C2 C10 C3 C11 C4 C12 C5 C13 C6 C14 C7 CN C8 CP Legenda: C1 - C14: Campioni da analizzare; CN: Controllo negativo di amplificazione; CP: Controllo positivo di amplificazione. Riferendosi alla documentazione dello strumento, impostare sul thermal cycler i parametri del ciclo termico indicando 45 cicli, un volume di reazione di 25 µl e, quando possibile, l'opzione "9600 emulation". Ciclo termico di amplificazione Fase Temperature Tempi Decontaminazione 50 C 2 min Denaturazione iniziale 95 C 10 min. 45 cicli 95 C 15 sec. 60 C 1 min. Allestimento dell'amplificazione (Da eseguire nell'area di estrazione / allestimento della reazione di amplificazione) Prima di iniziare la sessione è necessario: - prelevare e scongelare le provette con i campioni da analizzare. Agitare gentilmente le provette, centrifugarle per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerle in ghiaccio; - prelevare e scongelare le provette di AmpliMIX necessarie per la sessione ricordando che il contenuto di ciascuna provetta è sufficiente per allestire 24 reazioni. Agitare gentilmente le provette, centrifugarle per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerle in ghiaccio; - prelevare e scongelare un numero di provette di AmpliPROBE uguale a quello delle provette di AmpliMIX. Agitare gentilmente le provette, centrifugarle per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerle in ghiaccio; - prelevare un numero di provette di AmpliMASTER uguale a quello delle provette di AmpliMIX. Scrivere con inchiostro indelebile "LEGIO. pn." e la data sull'etichetta delle provette. Centrifugare le provette per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerle in ghiaccio; - prelevare e scongelare la provetta di Positive Control. Agitare gentilmente la provetta, centrifugarla per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerla in ghiaccio; - prelevare la Amplification microplate che sarà utilizzata nella sessione facendo attenzione a maneggiarla con guanti senza polvere e a non danneggiare i pozzetti. 1. Trasferire 100 µl di AmpliMIX nella provetta di AmpliMASTER. Mescolare bene pipettando per tre volte il volume di 100 µl nella mix. 2. Trasferire 100 µl di AmpliPROBE nella provetta di AmpliMASTER. Mescolare bene pipettando per tre volte il volume di 100 µl nella mix. 3. Miscelare per 5 secondi con il vortex a bassa velocità, evitando di produrre schiuma. 4. Centrifugare le provette per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto. 5. Trasferire, depositandoli accuratamente sul fondo, 20 µl della miscela di reazione così ottenuta nei pozzetti della Amplification microplate come stabilito precedentemente sul Piano di lavoro. Nota bene: Se non si utilizza tutta la miscela di reazione, conservare il volume rimasto al buio a - 20 C per un massimo di un mese nella provetta "LEGIO. pn.". Congelare e scongelare la miscela di reazione SOLO UNA VOLTA. 6. Trasferire, depositandoli accuratamente nella miscela di reazione, 5 µl di DNA estratto del primo campione nel corrispondente pozzetto della Amplification microplate come stabilito precedentemente sul Piano di lavoro, procedere ugualmente con tutti gli altri DNA estratti. 7. Trasferire, depositandoli accuratamente nella miscela di reazione, 5 µl di Acqua bidistillata sterile (non fornita nel prodotto) nel pozzetto della Amplification microplate del controllo negativo di amplificazione come stabilito precedentemente sul Piano di lavoro. 8. Trasferire, depositandoli accuratamente nella miscela di reazione, 5 µl di Positive Control nel corrispondente pozzetto della Amplification microplate come stabilito precedentemente sul Piano di lavoro. 9. Sigillare accuratamente la Amplification microplate con il Amplification Sealing Sheet. 10. Trasferire la Amplification microplate nel thermal cycler per real time posto nell'area di amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione e avviare il ciclo termico di amplificazione. SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 5/16 SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 6/16

5 Analisi qualitativa dei risultati I valori registrati della fluorescenza emessa dalla sonda specifica per L. pneumophila (detector FAM LEGIO.PN. ) e dalla sonda specifica per il Controllo Interno (detector VIC CI ) nelle reazioni di amplificazione devono essere analizzati con il software dello strumento. Prima di eseguire l'analisi, riferendosi alla documentazione dello strumento,è necessario: - impostare manualmente l'intervallo di calcolo del Livello di fluorescenza di fondo (Baseline) dal ciclo 6 al ciclo 15*; *Nota bene: Nel caso di un campione positivo ad alto titolo di L. pneumophila, la fluorescenza FAM della sonda specifica per L. pneumophila può cominciare a crescere prima del 15 ciclo. In questo caso l'intervallo di calcolo del Livello di fluorescenza di fondo deve essere adattato dal ciclo 6 al ciclo in cui la fluorescenza FAM comincia a crescere. - impostare manualmente la Soglia (Threshold) per la fluorescenza FAM LEGIO.PN. a 0,2; - impostare manualmente la Soglia (Threshold) per la fluorescenza VIC CI a 0,1. I valori di fluorescenza emessi dalle sonde specifiche nella reazione di amplificazione e il valore Soglia di fluorescenza permettono di determinare il Ciclo Soglia (Threshold cycle, Ct), il ciclo in cui è stato raggiunto il valore Soglia di fluorescenza. Nella reazione di amplificazione con il Positive Control, il valore di Ct della sonda specifica per L. pneumophila è utilizzato per convalidare l amplificazione e la rivelazione come descritto nella tabella seguente Reazione Positive Control L. pneumophila (FAM LEGIO.PN. ) Risultato del saggio Amplificazione / Rivelazione Ct 25 POSITIVO CORRETTA Se il risultato della reazione di amplificazione del Positive Control è Ct > 25 o Ct Non determinato (Undetermined), non è stata rivelata in modo corretto la presenza di DNA bersaglio. Si sono verificati problemi nella fase di amplificazione o di rivelazione (preparazione errata della miscela di reazione, dispensazione errata della miscela di reazione o del controllo positivo, degradazione della sonda o del controllo positivo, impostazione errata della posizione del controllo positivo, impostazione errata del ciclo termico) che possono causare risultati errati. La sessione non è valida e deve essere ripetuta dalla fase di amplificazione. Nella reazione di amplificazione di Controllo negativo, il valore di Ct della sonda specifica per L. pneumophila è utilizzato per convalidare l amplificazione e la rivelazione come descritto nella tabella seguente: Reazione Controllo negativo L. pneumophila (FAM LEGIO.PN. ) Risultato del saggio Amplificazione / Rivelazione Ct Non determinato NEGATIVO CORRETTA Se il risultato della reazione di amplificazione del Controllo negativo è diverso da Ct Non determinato (Undetermined), è stata rivelata la presenza di DNA bersaglio. Si sono verificati problemi nella fase di amplificazione (contaminazione) che possono causare risultati errati e falsi positivi. La sessione non è valida e deve essere ripetuta dalla fase di amplificazione. Nelle reazioni di amplificazione di ciascun campione, i valori di Ct della sonda specifica per L. pneumophila sono utilizzati per rivelare la presenza di DNA bersaglio, mentre i valori di Ct della sonda specifica per il Controllo Interno sono utilizzati per convalidare l estrazione, l amplificazione e la rivelazione. Nota bene: Verificare con il software dello strumento (Results, Amplification plot, delta Rn vs Cycle) che il Ct sia determinato da un rapido e regolare incremento dei valori di fluorescenza e non da fenomeni di picco o incremento del segnale di fondo. Questo prodotto è in grado di rivelare una quantità minima di circa 10 copie di DNA di L. pneumophila per reazione di amplificazione, corrispondenti a circa 10 genomi Equivalenti per reazione, (limite di rivelazione del prodotto, vedi paragrafo sulle Caratteristiche delle prestazioni a pagina 11). I risultati come Ct delle reazioni di amplificazione di ciascun campione sono utilizzati come descritto nella tabella seguente: L. pneumophila (FAM LEGIO.PN. ) Ct Non determinato Ct Determinato Reazione del campione Controllo Interno (VIC CI ) Ct > 35 o Ct Non determinato Idoneità del campione Risultato del saggio DNA di L. pneumophila non idoneo non valido - Ct 35 idoneo valido, negativo NON RIVELATO Ct > 35 o Ct Non determinato idoneo* valido, positivo PRESENTE Ct 35 idoneo valido, positivo PRESENTE Se il risultato della reazione di amplificazione di un campione è Ct Non determinato per la sonda specifica di L. pneumophila e Ct > 35 o Ct Non determinato per la sonda specifica per il Controllo Interno, non è stato possibile rivelare in modo efficiente il DNA del Controllo Interno. In questo caso si sono verificati problemi nella fase di amplificazione (amplificazione non efficiente o nulla) o nella fase di estrazione (perdita del DNA, presenza di inibitori, DNA del campione degradato o campione di partenza con un numero di cellule insufficiente) che possono causare risultati errati e falsi negativi. Il campione non è idoneo, il saggio non è valido e deve essere ripetuto a partire dall estrazione di un nuovo campione. Se il risultato della reazione di amplificazione di un campione è Ct Non determinato per la sonda specifica di L. pneumophila e Ct 35 per la sonda specifica per il Controllo Interno, il DNA di L. pneumophila non è stato rivelato nel DNA estratto dal campione ma non si può escludere che sia presente ad un titolo inferiore al limite di rivelazione del prodotto (vedi paragrafo sulle Caratteristiche delle prestazioni a pagina 11). In questo caso il risultato sarebbe un falso negativo. I risultati ottenuti con questo saggio devono essere interpretati considerando tutti i dati clinici e gli altri esami di laboratorio relativi al paziente. *Nota bene: Quando nella reazione di amplificazione relativa ad un campione è stata rivelata la presenza di DNA di L. pneumophila, l'amplificazione del Controllo Interno può dare come risultato un Ct > 35 o Ct Non determinato. Infatti la reazione di amplificazione a bassa efficienza del Controllo Interno può essere annullata dalla competizione con la reazione di amplificazione ad alta efficienza di L. pneumophila. In questo caso il campione è comunque idoneo e il risultato positivo del saggio è valido. SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 7/16 SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 8/16

6 Calcolo dei limiti di rivelazione Il limite di rivelazione, quando si utilizza una particolare metodica di estrazione e riferito ad una particolare unità di misura, può essere calcolato a partire dal limite di rivelazione del prodotto secondo questa formula: Ve x 10 geq Limite di rivelazione (geq / estrazione) = Va x Ee Ee è l'efficienza dell estrazione, per esempio con il prodotto «EXTRAcell» il parametro Ee è uguale a 1,0 (efficienza pari a circa il 100%). Ve è il volume totale del prodotto di estrazione, per esempio con il prodotto «EXTRAcell» il parametro Ve è uguale a 100 µl. Va è il volume del prodotto di estrazione usato nella reazione di amplificazione: con questo prodotto il parametro Va è uguale a 5 µl. Quando si utilizzano i kit di estrazione di ELITechGroup S.p.A. il limite è: Kit di estrazione «EXTRAcell» Formula semplificata Limite di rivelazione = 200 geq / estrazione LIMITI DELLA PROCEDURA Utilizzare con questo prodotto soltanto il DNA estratto dai seguenti campioni umani: escreato, lavaggi bronco-alveolari (BAL), bronco-tracheo aspirati (BA). Non utilizzare con questo prodotto DNA estratto contaminato da emoglobina e mucoproteine: emoglobina e mucoproteine inibiscono la reazione di amplificazione degli acidi nucleici e possono causare risultati non validi. Non sono disponibili dati riguardo eventuali fenomeni di inibizione da parte di farmaci antivirali, antibiotici, chemioterapici o immunosopressori. I risultati ottenuti con questo prodotto dipendono dalla corretta raccolta, trasporto, conservazione e preparazione dei campioni; per evitare risultati errati è quindi necessario porre particolare cura durante queste fasi e seguire attentamente le istruzioni fornite con i prodotti per l'estrazione degli acidi nucleici. La metodica di amplificazione real time degli acidi nucleici utilizzata in questo prodotto, a causa della sua elevata sensibilità analitica, è soggetta a contaminazione da parte di campioni clinici positivi per L. pneumophila, dei controlli positivi e degli stessi prodotti della reazione di amplificazione. Le contaminazioni portano a risultati falsi positivi. Le modalità di realizzazione del prodotto sono in grado di limitare le contaminazioni; tuttavia questi fenomeni possono essere evitati solo con una buona pratica delle tecniche di laboratorio e seguendo attentamente le istruzioni fornite in questo manuale. Questo prodotto richiede personale addestrato alla manipolazione di campioni biologici in grado di trasmettere agenti infettivi e di preparati chimici classificati pericolosi per evitare incidenti con conseguenze potenzialmente gravi per l'utilizzatore o altre persone. Questo prodotto richiede indumenti di lavoro e aree di lavoro adeguate alla manipolazione di campioni biologici in grado di trasmettere agenti infettivi e di preparati chimici classificati pericolosi per evitare incidenti con conseguenze potenzialmente gravi per l'utilizzatore o altre persone. Questo prodotto richiede personale addestrato per le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici per evitare risultati errati. Questo prodotto richiede aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione per evitare risultati falsi positivi. Questo prodotto richiede indumenti di lavoro e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione per evitare risultati falsi positivi. Un risultato negativo ottenuto con questo prodotto indica che il DNA di L. pneumophila non è stato rivelato nel DNA estratto dal campione ma non si può escludere che il DNA di L. pneumophila sia presente ad un titolo inferiore al limite di rivelazione del prodotto (vedi paragrafo sulle Caratteristiche delle prestazioni a pagina 11); in questo caso il risultato sarebbe un falso negativo. Come per qualunque altro dispositivo diagnostico, i risultati ottenuti con questo prodotto devono essere interpretati considerando tutti i dati clinici e gli altri esami di laboratorio relativi al paziente. Come per qualunque altro dispositivo diagnostico, esiste un rischio residuo di ottenere risultati non validi, falsi positivi e falsi negativi con questo prodotto. Questo rischio residuo non può essere eliminato o ridotto ulteriormente. Questo rischio residuo in situazioni particolari, come le diagnosi di urgenza, può contribuire a decisioni errate con conseguenze potenzialmente gravi per il paziente. SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 9/16 SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 10/16

7 Sensibilità analitica: limite di rivelazione CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI La sensibilità analitica di questo saggio permette di identificare la presenza di circa 10 molecole di DNA bersaglio nei 5 µl di DNA estratto aggiunti alla reazione di amplificazione. La sensibilità analitica del saggio, come limite di rivelazione, è stata testata utilizzando un DNA plasmidico contenente il prodotto di amplificazione la cui concentrazione iniziale è stata misurata spettrofotometricamente. Il DNA plasmidico è stato diluito ad un titolo di 10 copie / 5 µl in DNA genomico umano ad un titolo di 500 ng / 5 µl. Questo campione è stato impiegato in 50 replicati per eseguire l'amplificazione con i prodotti ELITechGroup S.p.A. (vedi paragrafo sui prodotti accessori). I risultati finali sono riassunti nella tabella seguente. Campioni N positivi negativi 10 copie DNA plasmidico ng di DNA genomico umano Sensibilità analitica: riproducibilità con pannello per proficiency test La sensibilità analitica del saggio, come riproducibilità dei risultati a confronto con i risultati ottenuti con altre metodiche e in diversi laboratori, è stata verificata con due pannelli per proficiency test. La prima prova è stata eseguita utilizzando come materiale di riferimento calibrato un pannello di diluizioni di L. pneumophila sierogruppo 1 in PBS o in BAL entro la concentrazione limite (QCMD 2004 Legionella pneumophila pilot proficency panel, Qnostics Ltd, Regno Unito). Ciascun campione del pannello è stato impiegato per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione e amplificazione, con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Prove con QCMD 2004 L. pneumophila pilot proficency panel Campione Valore dichiarato cfu / ml Risultato atteso Risultato ottenuto LP04-01 n/a negativo (non pervenuto) LP04-02 n/a negativo negativo LP ,8x10 3 positivo positivo LP ,8x10 5 positivo positivo LP ,8x10 1 positivo positivo LP04-06 n/a negativo negativo LP ,8x10 1 positivo negativo LP ,8x10 3 positivo positivo LP04-09 n/a negativo negativo LP ,8x10 5 positivo positivo Il campione LP05B-07 ha dato un risultato negativo discordante confermato quando l'amplificazione è stata ripetuta. La discordanza tra il risultato ottenuto con i prodotti ELITechGroup S.p.A. e quello atteso può essere spiegato considerando che la quantità di campione era di 0,5 ml (pari a 9 cfu) e che solo 1/20 del prodotto di estrazione è stato utilizzato nella reazione di amplificazione (pari a 0,45 cfu). Il campione era perciò al di sotto del limite di rivelazione del saggio in un ambito in cui si ha una bassa probabilità di ottenere risultati positivi. Inoltre questo campione è stato identificato in modo errato nell'84,2% dei casi durante il QCMD 2004 Legionella pneumophila pilot proficency programme (dati della QCMD, Regno Unito). La seconda prova è stata eseguita utilizzando come materiale di riferimento calibrato un pannello di diluizioni di L. pneumophila sierogruppo 1 (sg1, ATCC 33152) e sierogruppo 6 (sg6, NCTC 11287) in soluzione fisiologica entro la concentrazione limite (QCMD 2005 Legionella pneumophila pilot proficiency panel, Qnostics Ltd, Regno Unito). Il pannello conteneva anche diluizioni di L. micdadei (NCTC 11371). Ciascun campione del pannello è stato impiegato per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione e amplificazione, con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Prove con QCMD 2005 L. pneumophila pilot proficency panel Campione Valore dichiarato cfu / ml Risultato atteso Risultato ottenuto LP05B-01 L. p. negativo negativo negativo LP05B-02 L. m. 1,8x10 3 negativo negativo LP05B-03 L. p. sg6 1,8x10 3 positivo positivo LP05B-04 L. p. sg1 1,8x10 4 positivo negativo / positivo LP05B-05 L. p. sg6 1,8x10 5 positivo positivo LP05B-06 L. m. 1,8x10 5 negativo negativo LP05B-07 L. p. sg1 1,8x10 3 positivo positivo LP05B-08 L. p. sg1 1,8x10 1 positivo negativo LP05B-09 L. p. sg6 1,8x10 1 positivo negativo / positivo LP05B-10 L. p. sg1 1,8x10 5 positivo positivo LP05B-11 L. p. negativo negativo negativo LP05B-12 L. p. sg1 1,8x10 1 positivo negativo Il campione LP05B-04 ha dato un risultato negativo discordante ma ripetuto si è dimostrato positivo. Il campione LP05B-09 ha dato un risultato negativo discordante ma ripetuto si è dimostrato positivo. I campioni LP05B-08 e LP05B-12 hanno dato un risultato negativo discordante confermato quando l'amplificazione è stata ripetuta. La discordanza tra i risultati ottenuti con i prodotti ELITechGroup S.p.A. e quelli attesi può essere spiegato considerando che la quantità di campione era di 0,5 ml (pari a 9 cfu) e che solo 1/20 del prodotto di estrazione è stato utilizzato nella reazione di amplificazione (pari a 0,45 cfu). Il campione era perciò al di sotto del limite di rivelazione del saggio in un ambito in cui si ha una bassa probabilità di ottenere risultati positivi. Inoltre questi campioni sono stato identificato in modo errato nell'87,8% dei casi durante il QCMD 2005 Legionella pneumophila pilot study (dati della QCMD, Regno Unito). Sensibilità diagnostica: efficienza di rivelazione su diversi genotipi / sottotipi La sensibilità diagnostica del saggio, come efficienza di rivelazione su diversi genotipi / sottotipi, è stata valutata per confronto di sequenze con banche dati nucleotidiche. L'esame delle regioni scelte per l'ibridazione degli oligonucleotidi di innesco AmpliMIX e della sonda fluorescente AmpliPROBE sull'allineamento delle sequenze disponibili in banca dati del gene mip di L. pneumophila ha dimostrato la loro conservazione e l'assenza di mutazioni significative. La sensibilità diagnostica del saggio, come efficienza di rivelazione su diversi genotipi / sottotipi è stata valutata eseguendo l'analisi su campioni positivi per L. pneumophila sg1 e per L. pneumophila sg6. La sensibilità diagnostica del saggio è stata valutata utilizzando come materiale di riferimento campioni certificati positivi per il DNA di L. pneumophila sg1, ATCC 33152, e di L. pneumophila sg6, NCTC 11287, (QCMD 2005 Legionella pneumophila pilot proficiency panel, Qnostics Ltd, Regno Unito). Ciascun campione è stato impiegato per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione e amplificazione, con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella relativa alla "Sensibilità analitica: riproducibilità con pannello per proficiency test". SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 11/16 SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 12/16

8 Sensibilità diagnostica: campioni positivi La sensibilità diagnostica del saggio, come conferma di campioni clinici positivi, è stata verificata eseguendo l'analisi su alcuni campioni clinici positivi per il DNA di L. pneumophila. La sensibilità diagnostica è stata valutata utilizzando come materiale di riferimento il DNA estratto da 5 campioni di espettorato, 3 campioni di BA e 2 campioni di BAL, positivi per il DNA di L. pneumophila (testati con una metodica di amplificazione nested o con una metodica di amplificazione real time). Ciascun campione è stato impiegato per eseguire l'amplificazione con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Campioni N positivi negativi Estratti positivi per il DNA di L. pneumophila Un campione di BAL ha dato un risultato negativo discordante con i prodotti ELITechGroup S.p.A.. Questo campione è stato ritestato con la metodica di amplificazione nested ed ha dato un risultato negativo. Le discordanze possono essere spiegate con un titolo del DNA di L. pneumophila inferiore al limite di rivelazione dei due saggi che produrrebbe risultati positivi in modo casuale. Specificità analitica: marcatori potenzialmente interferenti La specificità analitica del saggio, come assenza di crossreattività con altri marcatori potenzialmente interferenti, è stata valutata per confronto di sequenze con banche dati nucleotidiche. L'esame dell'allineamento delle sequenze degli oligonucleotidi di innesco delle AmpliMIX e delle sonde fluorescenti AmpliPROBE con le sequenze disponibili in banca dati di organismi diversi da L. pneumophila, tra cui quelle dei genomi completi di Chlamydophila pneumoniae e Mycoplasma pneumoniae, ha dimostrato la loro specificità e l'assenza di omologie significative. La specificità analitica del saggio, come assenza di crossreattività con altri marcatori potenzialmente interferenti, è stata verificata eseguendo l'analisi su campioni certificati positivi per Legionella micdadei, Chlamydophila pneumoniae e Mycoplasma pneumoniae. La specificità analitica del saggio è stata valutata utilizzando come materiale di riferimento campioni certificati positivi ad alto titolo per il DNA di Chlamydophila pneumoniae, ceppo CM-1, ATCC VR-1360, (Vircell S.L., Spagna), per il DNA di Mycoplasma pneumoniae, ceppo FH, ATCC 15531, (Vircell S.L., Spagna), e per il DNA di Legionella micdadei, ceppo NCTC (Qnostisc Ltd, Regno Unito). Questi microrganismi causano infezioni respiratorie e si trovano frequentemente negli stessi campioni clinici. Ciascun campione è stato impiegato per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione e amplificazione, con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Campioni N positivi negativi Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Legionella micdadei Specificità diagnostica: campioni negativi La specificità diagnostica del saggio, come conferma di campioni clinici negativi, è stata verificata eseguendo l'analisi su alcuni campioni cellulari negativi per il DNA di L. pneumophila ed è risultata uguale al 98,2%. La specificità diagnostica è stata valutata utilizzando come materiale di riferimento campioni clinici di BAL e BA negativi per il DNA di L. pneumophila (testati con una metodica di amplificazione nested). Ciascun campione del pannello è stato impiegato per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione e amplificazione, con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Campioni N positivi negativi Cellule negative per il DNA di L. pneumophila Un campione ha dato un risultato positivo discordante con i prodotti ELITechGroup S.p.A.. Questo campione è stato ritestato ed ha nuovamente dato un risultato positivo. Il campione è stato valutato a livello quantitativo e ha dimostrato un titolo inferiore a 10 geq / reazione che è al di sotto del limite di rivelazione del prodotto e del sistema di amplificazione nested utilizzato per testare i campioni. A titoli così bassi i campioni possono produrre risultati positivi in modo casuale. Un campione ha dato un risultato non valido. Robustezza: effetto della matrice La robustezza del saggio, come effetto della matrice che porta a risultati falsi negativi, è stata verificata eseguendo l'analisi di un pannello di estratti da campioni clinici resi positivi per il DNA di L. pneumophila ad un titolo vicino al limite di rivelazione. L'effetto della matrice è stato valutato utilizzando come materiale di riferimento campioni di DNA estratto da BAL e BA negativi per il DNA di L. pneumophila testati con una metodica di amplificazione nested e positivizzati con il DNA plasmidico diluito ad un titolo di 30 copie / 5 µl (3 volte il limite di rivelazione). Questi campioni sono stati impiegati per eseguire l'amplificazione con i prodotti ELITechGroup S.p.A.. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Campioni N positivi negativi Estratti positivizzati per il DNA di L. pneumophila Nota bene: I dati e i risultati completi delle prove eseguite per la valutazione delle caratteristiche delle prestazioni del prodotto sono registrati nella Sezione 7 del Fascicolo Tecnico di Prodotto "LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliMIX e LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliPROBE", FTP RTS096. BIBLIOGRAFIA M. Koide et al. (1995) Clin Inf Dis 21: SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 13/16 SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 14/16

9 PROBLEMI E SOLUZIONI LEGENDA DEI SIMBOLI DNA bersaglio non rivelato nella reazione del Positive Control Possibili cause Errore nella preparazione della miscela di reazione. Errore nella dispensazione nella micropiastra. Soluzioni Controllare i volumi di reagenti dispensati durante la preparazione della miscela di reazione. Dispensare con cura le reazioni nella micropiastra seguendo il piano di lavoro. Controllare i volumi di miscela di reazione dispensati. Controllare il volume di controllo positivo dispensato. Numero di catalogo. Limite superiore di temperatura. Codice del lotto. Degradazione della sonda. Degradazione del controllo positivo Utilizzare una nuova aliquota di sonda. Utilizzare una nuova aliquota di controllo positivo. Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese). Errore nell impostazione dello strumento. DNA bersaglio rivelato nella reazione di Controllo negativo Controllare la posizione impostata sullo strumento delle reazioni del controllo positivo. Controllare il ciclo termico impostato sullo strumento. Dispositivo medico diagnostico in vitro. Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici diagnostici in vitro. Possibili cause Errore nella dispensazione nella micropiastra. Soluzioni Evitare di spargere il contenuto delle provette dei campioni. Cambiare sempre puntale tra un campione e l altro. Dispensare con cura campioni, controllo negativo e controllo positivo nella micropiastra seguendo il piano di lavoro. CONT Contenuto sufficiente per "N" test. Contenuto. Errore durante l impostazione dello strumento. Controllare la posizione di campioni, controllo negativo, e controllo positivo impostata sullo strumento. Attenzione, consultare le istruzioni per l uso. Micropiastra sigillata male. Sigillare con attenzione la micropiastra. Contaminazione dell'acqua bidistillata sterile. Utilizzare una nuova aliquota di acqua sterile. Fabbricante. Contaminazione della mix di amplificazione. Utilizzare una nuova aliquota di mix di amplificazione. Contaminazione dell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. Presenza di fluorescenza di fondo elevata nelle reazioni Pulire superfici e strumenti con detergenti acquosi, lavare camici, sostituire provette e puntali in uso. Possibili cause Errore nella impostazione della "baseline". Soluzioni Impostare l'intervallo di calcolo della "baseline" in un ambito di cicli in cui la fluorescenza di fondo sia già stabilizzata (controllare le registrazioni "component") e la fluorescenza del segnale non abbia ancora cominciato a crescere, per esempio dal ciclo 9 al ciclo 15. L'acquisto di questo prodotto permette all'acquirente di utilizzarlo per l'amplificazione e la rivelazione di sequenze di acidi nucleici al fine di fornire servizi di diagnostica umana in vitro. Questo diritto è conferito solo se il prodotto fornito è utilizzato insieme ai prodotti licenziati "Positive Control" e "Q - PCR Standard" di ELITechGroup S.p.A. Nessun diritto generale o altra licenza di alcun tipo diversa da questo specifico diritto d'uso è conferito per mezzo dell'acquisto. SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 15/16 SCH mrts096m 28/05/13 Revisione 03 Pag. 16/16

10 PIANO DI LAVORO A B C D E F G H

11 LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliPROBE RTS096-P LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliPROBE RTS096-P SOMMARIO USO PREVISTO pag. 1 DESCRIZIONE DEL PRODOTTO pag. 1 MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO pag. 2 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO pag. 2 ALTRI PRODOTTI RICHIESTI pag. 2 AVVERTENZE E PRECAUZIONI pag. 2 PROCEDURA pag. 4 BIBLIOGRAFIA pag. 4 LEGENDA DEI SIMBOLI pag. 4 USO PREVISTO Il prodotto «LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliPROBE» è parte di un saggio qualitativo di amplificazione degli acidi nucleici per la ricerca del DNA di Legionella pneumophila (L. pneumophila) in campioni di DNA estratto da escreato, lavaggi bronco-alveolari (BAL), bronco-tracheo aspirati (BA). Il prodotto trova impiego, insieme ai dati clinici e ad altri esami di laboratorio, nella diagnosi e nel monitoraggio dell'infezione da L. pneumophila. DESCRIZIONE DEL PRODOTTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com sito WEB: Il prodotto fornisce la miscela di sonde fluorescenti AmpliPROBE per l'amplificazione real time in una soluzione stabilizzante, prealiquotata in quattro provette monouso. Ogni provetta contiene 110 µl di soluzione, sufficiente per 24 reazioni. La sonda marcata con il fluoroforo FAM e bloccata dal gruppo MGB-NFQ, è specifica per una regione del gene mip di L. pneumophila. La sonda per il controllo interno di idoneità del campione, marcata con il fluoroforo VIC e bloccata dal gruppo MGB-NFQ, è specifica per la regione promotore e 5' UTR del gene umano della beta Globina. La procedura prevede l'esecuzione di una reazione di amplificazione real time in micropiastra con un termostato programmabile con sistema ottico di rilevamento della fluorescenza (thermal cycler per real time). La standardizzazione del sistema è stata eseguita su strumenti Applied Biosystems ABI PRISM della serie Il prodotto consente di effettuare 96 determinazioni, controlli positivi e negativi compresi. -20 C MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO Componente Descrizione Quantità Composizione Etichettatura LEGIO. pn. AmpliPROBE miscela di sonde fluorescenti marcate con FAM / MGB-NFQ e con VIC / MGB-NFQ 4 x 110 µl Oligonucleotidi fluorescenti, TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerolo, Triton X-100 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO - Cappa a flusso laminare. - Guanti senza polvere monouso in lattice o simili. - Miscelatore vortex. - Microcentrifuga da banco ( RPM). - Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Acqua bidistillata sterile. - Termostato programmabile con sistema ottico di rilevamento della fluorescenza. ALTRI PRODOTTI RICHIESTI I reagenti per l'estrazione del DNA dai campioni da analizzare, il controllo positivo di estrazione, i reagenti ottimizzati per l'amplificazione, i reagenti di innesco (oligonucleotidi) e il controllo positivo di amplificazione non sono inclusi in questo prodotto. Per eseguire queste fasi analitiche si consiglia l impiego dei seguenti prodotti accessori di ELITechGroup S.p.A.: «EXTRAcell» (codice EXTD02), kit di estrazione del DNA da campioni cellulari; il kit consente di effettuare 50 estrazioni. «CPE - DNA - Internal Control» (codice CTREXTG) o «CPE - Internal Control» (codice CTRCPE), controllo positivo di estrazione di DNA plasmidico per estrazioni del DNA da campioni non cellulari. «Q - PCR Alert AmpliMASTER» (codice RTS000), miscela di reagenti ottimizzati, micropiastre e fogli adesivi per l'amplificazione real time; il prodotto consente di effettuare 96 reazioni. (codice ), oligonucleotidi di innesco per l'amplificazione real time; il prodotto consente di effettuare 96 reazioni. «LEGIONELLA pn. - Positive Control» (codice CTR096), controllo positivo di DNA plasmidico; il prodotto consente di effettuare 16 sessioni. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Questo prodotto è riservato esclusivamente all'uso in vitro. Avvertenze e precauzioni generali Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno 30 minuti oppure trattato in autoclave a 121 C per un' ora prima di essere smaltito. Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero potenzialmente infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere neutralizzati prima dell'eliminazione. - SCH mrts096p 28/05/13 Revisione 02 Pag. 1/4 SCH mrts096p 28/05/13 Revisione 02 Pag. 2/4

12 LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliPROBE RTS096-P LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliPROBE RTS096-P Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi / la faccia. Non pipettare a bocca alcuna soluzione. Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro. Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti. Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti. Leggere tutte le istruzioni fornite nel prodotto prima di eseguire il saggio. Attenersi alle istruzioni fornite nel prodotto durante l'esecuzione del saggio. Rispettare la data di scadenza del prodotto. Utilizzare solo i reagenti presenti nel prodotto e quelli consigliati dal produttore. Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi. Non utilizzare reagenti provenienti da prodotto di altri produttori. Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici, richiedono personale addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni da parte di prodotti di amplificazione. E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai introdurre un prodotto di amplificazione nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai trasferire camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione all'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai essere aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso. Avvertenze e precauzioni specifiche per i reagenti Le provette contenenti l'ampliprobe sono monouso e pertanto devono essere utilizzate una volta sola nella preparazione della miscela di reazione. L'AmpliPROBE presenta i seguenti consigli di prudenza (S): S Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi. PROCEDURA Il prodotto «LEGIONELLA pn. Q - PCR Alert AmpliPROBE» deve essere utilizzato con i prodotto «Q - PCR Alert AmpliMASTER» e per ottenere la miscela di reazione. L'AmpliPROBE è pronto all'uso, pertanto deve essere utilizzato aggiungendolo direttamente alla miscela di reazione. La procedura completa, che prevede l'allestimento e l'esecuzione di una reazione di amplificazione real time in micropiastra con un termostato programmabile con sistema ottico di rilevamento della fluorescenza (thermal cycler per real time), è descritta in modo dettagliato nel manuale di istruzioni per l'uso allegato al prodotto. Le caratteristiche delle prestazioni e i limiti della procedura del saggio completo di ricerca e dosaggio del DNA di L. pneumophila sono descritte in modo dettagliato nel manuale di istruzioni per l'uso allegato al prodotto. CONT Numero di catalogo. BIBLIOGRAFIA M. Koide et al. (1995) Clin Inf Dis 21: Limite superiore di temperatura. Codice del lotto. LEGENDA DEI SIMBOLI Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese). Dispositivo medico diagnostico in vitro. Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici diagnostici in vitro. Contenuto sufficiente per "N" test. Contenuto. Attenzione, consultare le istruzioni per l uso. Fabbricante. L'acquisto di questo prodotto permette all'acquirente di utilizzarlo per l'amplificazione e la rivelazione di sequenze di acidi nucleici al fine di fornire servizi di diagnostica umana in vitro. Questo diritto è conferito solo se il prodotto fornito è utilizzato insieme ai prodotti licenziati "Positive Control" e "Q - PCR Standard" di ELITechGroup S.p.A.. Nessun diritto generale o altra licenza di alcun tipo diversa da questo specifico diritto d'uso è conferito per mezzo dell'acquisto. SCH mrts096p 28/05/13 Revisione 02 Pag. 3/4 SCH mrts096p 28/05/13 Revisione 02 Pag. 4/4

13 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagenti ottimizzati per l'amplificazione real time RTS000 RTS000/2 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagenti ottimizzati per l'amplificazione real time RTS000 RTS000/2 SOMMARIO USO PREVISTO pag. 1 DESCRIZIONE DEL PRODOTTO pag. 1 MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO pag. 2 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO pag. 2 ALTRI PRODOTTI RICHIESTI pag. 2 AVVERTENZE E PRECAUZIONI pag. 3 PROCEDURA pag. 4 LEGENDA DEI SIMBOLI pag. 4 USO PREVISTO Il prodotto «Q - PCR Alert AmpliMASTER» è parte di saggi quantitativi di amplificazione degli acidi nucleici per la ricerca e il dosaggio di un DNA bersaglio con la metodica dell'amplificazione real time in campioni di DNA estratto o di cdna ottenuto per trascrizione inversa da RNA estratto e per la determinazione allelica con la metodica dell'amplificazione real time in campioni di DNA estratto. Il prodotto è un accessorio dei prodotti della serie «Q - PCR Alert AmpliMIX», «Q - PCR Alert AmpliPROBE», «Q - PCR Standard» e «Positive Control» dell ELITechGroup S.p.A. Il prodotto trova impiego nell'allestimento di saggi diagnostici basati sulla metodica dell'amplificazione real time. DESCRIZIONE DEL PRODOTTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com sito WEB: +2 C +8 C Il prodotto nel formato intero (codice RTS000) fornisce la miscela di reagenti ottimizzati per l'amplificazione real time AmpliMASTER, in una soluzione stabilizzante aliquotata in quattro provette e pronta all'uso, tre Micropiastre per amplificazione da 96 pozzetti e tre Fogli adesivi per amplificazione. Il prodotto nel formato ridotto (codice RTS000/2) fornisce la miscela di reagenti ottimizzati per l'amplificazione real time AmpliMASTER, in una soluzione stabilizzante aliquotata in due provette e pronta all'uso, due Micropiastre per amplificazione da 96 pozzetti e due Fogli adesivi per amplificazione. La miscela di reagenti fornisce il sistema tampone, il magnesio cloruro, i nucleotidi trifosfati, il fluoroforo ROX di riferimento passivo per la normalizzazione della fluorescenza, l'enzima Uracil-N-glicosidasi (UNG) per l'inattivazione delle contaminazioni da prodotto di amplificazione, l'enzima Taq DNA polimerasi ad attivazione termica (hot start). Il prodotto nel formato intero (codice RTS000) consente di effettuare 96 determinazioni, standard e controlli compresi. Il prodotto nel formato ridotto (codice RTS000/2) consente di effettuare 48 determinazioni, standard e controlli compresi. Prodotto formato intero codice RTS000 MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO Componente Descrizione Quantità Composizione Etichettatura AmpliMASTER miscela di reagenti ottimizzati 4 x 340 µl Amplification microplate micropiastra a 96 pozzetti da 0,2 ml TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerolo, Cloruro di magnesio, Desossiribonucleotidi trifosfati, ROX, Uracil-N-glicosidasi, Taq DNA polimerasi Amplification Sealing Sheet foglio adesivo sigillante Prodotto formato ridotto codice RTS000/2 Componente Descrizione Quantità Composizione Etichettatura AmpliMASTER miscela di reagenti ottimizzati 2 x 340 µl Amplification microplate micropiastra a 96 pozzetti da 0,2 ml TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerolo, Cloruro di magnesio, Desossiribonucleotidi trifosfati, ROX, Uracil-N-glicosidasi, Taq DNA polimerasi Amplification Sealing Sheet foglio adesivo sigillante MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO - Cappa a flusso laminare. - Guanti monouso senza polvere in lattice o simili. - Miscelatore vortex. - Microcentrifuga da banco ( RPM). - Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Acqua bidistillata sterile. - Termostato programmabile con sistema ottico di rilevamento della fluorescenza (thermal cycler per real time). ALTRI PRODOTTI RICHIESTI I reagenti di innesco (oligonucleotidi), i reagenti di rivelazione (sonde fluorescenti), i DNA standard a quantità nota e i controlli positivi di DNA plasmidico non sono inclusi in questo prodotto. Per eseguire queste fasi analitiche si consiglia l impiego dei seguenti prodotti accessori dell ELITechGroup S.p.A.: serie «Q - PCR Alert AmpliMIX», oligonucleotidi di innesco per l'amplificazione real time. serie «Q - PCR Alert AmpliPROBE», sonde fluorescenti per l'amplificazione real time. serie «Q - PCR Standard», DNA plasmidico a quantità nota per ottenere la curva standard. serie «Positive Control», controllo positivo di DNA plasmidico. - - Nota bene: le Micropiastre per amplificazione non devono essere utilizzate con gli strumenti Applied Biosystems della serie 7000 che montano il blocco termico "FAST". SCH mrts000 28/05/11 Revisione 04 Pag. 1/4 SCH mrts000 28/05/11 Revisione 04 Pag. 2/4

14 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagenti ottimizzati per l'amplificazione real time RTS000 RTS000/2 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagenti ottimizzati per l'amplificazione real time RTS000 RTS000/2 AVVERTENZE E PRECAUZIONI Questo prodotto è riservato esclusivamente all'uso in vitro. Avvertenze e precauzioni generali Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno 30 minuti oppure trattato in autoclave a 121 C per un' ora prima di essere smaltito. Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero potenzialmente infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere neutralizzati prima dell'eliminazione. Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi / la faccia. Non pipettare a bocca alcuna soluzione. Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro. Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti. Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti. Leggere tutte le istruzioni fornite nel prodotto prima di eseguire il saggio. Attenersi alle istruzioni fornite nel prodotto durante l'esecuzione del saggio. Rispettare la data di scadenza del prodotto. Utilizzare solo i reagenti presenti nel prodotto e quelli consigliati dal produttore. Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi. Non utilizzare reagenti provenienti da prodotti di altri produttori. Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici, richiedono personale addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni da parte di prodotti di amplificazione. E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai introdurre un prodotto di amplificazione nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai trasferire camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione all'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai essere aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso. Avvertenze e precauzioni specifiche per i componenti L'AmpliMASTER non presenta frasi di rischio (R) e presenta i seguenti consigli di prudenza (S): S Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi. PROCEDURA Il prodotto «Q - PCR Alert AmpliMASTER» deve essere utilizzato con i prodotti della serie «Q - PCR Alert AmpliMIX» e «Q - PCR Alert AmpliPROBE» per ottenere la miscela di reazione. L'AmpliMASTER è pronta all'uso, pertanto deve essere utilizzata direttamente nella preparazione della miscela di reazione. La procedura completa, che prevede l'allestimento e l'esecuzione di una reazione di amplificazione real time in micropiastra con un termostato programmabile con sistema ottico di rilevamento della fluorescenza (thermal cycler per real time), è descritta in modo dettagliato nel manuale di istruzioni per l'uso allegato ai prodotti della serie «Q - PCR Alert AmpliMIX». Le caratteristiche delle prestazioni e i limiti della procedura dei saggi completi di ricerca e dosaggio del DNA bersaglio sono descritte in modo dettagliato nei manuali di istruzioni per l'uso allegati ai prodotti della serie «Q - PCR Alert AmpliMIX». CONT Numero di catalogo. Limiti di temperatura. Codice del lotto. LEGENDA DEI SIMBOLI Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese). Dispositivo medico diagnostico in vitro. Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici diagnostici in vitro. Contenuto sufficiente per "N" test. Contenuto. Attenzione, consultare le istruzioni per l uso. Fabbricante. L'acquisto di questo prodotto permette all'acquirente di utilizzarlo per l'amplificazione e la rivelazione di sequenze di acidi nucleici al fine di fornire servizi di diagnostica umana in vitro. Questo diritto è conferito solo se il prodotto fornito è utilizzato insieme ai prodotti licenziati "Positive Control" o Q - PCR Standard dell ELITechGroup S.p.A. Nessun diritto generale o altra licenza di alcun tipo diversa da questo specifico diritto d'uso è conferito per mezzo dell'acquisto. SCH mrts000 28/05/11 Revisione 04 Pag. 3/4 SCH mrts000 28/05/11 Revisione 04 Pag. 4/4