Analisi Immunoenzimatiche

Dimensione: px

Iniziare la visualizzazioe della pagina:

Download "Analisi Immunoenzimatiche"

Linda Valenti
6 anni fa
Visualizzazioni

1 Analisi Immunoenzimatiche Mara Stefanelli INAIL Dipartimento Innovazioni Tecnologiche e Sicurezza degli Impianti, Prodotti e Insediamenti antropici Istituto Superiore di Sanità Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Reparto Qualità degli Ambienti Acquatici e delle Acque di Balneazione

2 Metodi immunoenzimatici: Enzyme Linked Immunosorbend Assay (ELISA) Test immunoenzimatico che si basa sull interazione antigene/anticorpo per identificare e quantificare una sostanza chimica Rapidi (da pochi minuti a qualche ora) Di facile applicazione Analisi mediante una ridotta quantità di campione Disponibilità dei Kit in commercio Relativamente poco costosi Hanno un accuratezza ed una precisione idonei allo scopo (SCREENING) Non competitivi: relazione antigene (cianotossina) anticorpo: DIRETTA Competitivi: relazione antigene (cianotossina) anticorpo: INVERSA DIRETTI INDIRETTI

3 Competitivi DIRETTI INDIRETTI 1 Complesso MC-LR-perossidasi MC nel campione Complesso MC-LRBSA adeso al supporto MC nel campione ambientale Anticorpo primario Piastra pre-coated con anticorpi policlonali anti MC 2 Anticorpo secondario Fase a: Fissato al substrato un anticorpo specifico per l antigene che vogliamo ricercare Fase a: Campione biologico direttamente legato al substrato Fase b: Aggiunta campione biologico da testare per verificare la presenza dell antigene (legame anticorpo-antigene) Fase b: Inserimento di anticorpi conosciuti per reagire contro l antigene (legame anticorpo-antigene) Fase c: Inserimento di un secondo anticorpo marcato che lega il primo Fase c: Inserimento di un secondo anticorpo marcato che lega il primo

4 Tipologia di ELISA disponibili Strips, in forma di piastre da 96 pozzetti, con anticorpo adeso sul fondo Per: MC, CYL, SXT, NEO, BMAA(ricerca) Usati su campioni: acque dolci, marine, salmastre, estratti algali e acque potabili (diverse procedure di preparazione - seguire istruzioni) Semplici da usare Risposta rapida Risultati semi-quantitativi Anatossina-a: Receptor Binding Assay (PBA) Procedura ELISA ma basato su affinità dell anatossina-a per recettori nicotinici dell nachrs Concentrazioni:10-50ppb, LOD: 10ppb 96 pozzetti, 37 C, 3h30min Non esporre il campione alla luce (degradazione Ana-a)

5 Semplici da usare Risposta rapida Risultati qualitativi in tempo reale mediante l uso di un lettore portatile Risultati semi-quantitativi in laboratorio (uso di standard) Test tube (MC) Strip test: Lisi cellulare MC tot Livelli misurati: 110µg/L): limiti acque balneazione Strip test (MC) Test Tube: no lisi cellulare MC libera Livelli misurati: 0,53µg/L): limiti acque potabili Necessitano ancora di studi ma per valutazioni del tutto preliminari sembrano attendibili

6 Protocollo di analisi ELISA su micropiastra ed eventuali interferenze Preparazione del campione Campione d acqua raccolto in contenitori idonei -20 C Durante il trasporto i campioni devono essere mantenuti in CONTENITORI IDONEI* (vetro) e a TEMPERATURA CONTROLLATA* (contenitori refrigerati) Mischiare bene la bottiglia, prelevare un sub-campione (5ml) e lisare le cellule Per poter analizzare la concentrazione di cianotossine totali il campione tal quale deve essere trattato al fine di provocare la completa LISI CELLULARE* - congelare/scongelare per 3 volte - bagno ad ultrasuoni - kit per lisi cellulare Filtrare il campione usando una siringa, con posizionato un filtro da 0,2µm e raccogliere il campione in una provetta da 5ml Filtrare il campione per ELIMINARE TUTTI I RESIDUI CELLULARI*, che potrebbero interferire con il test Analizzare il campione Seguire tutte le fasi del test riportate sulle istruzioni. Prima di iniziare il test mantenere il kit a T ambiente per almeno 30min* FASE 2 FASE 1 *possibili interferenze e cause di errore

7 Interferenze e cause di errore Fase 3: dispensazione dei campioni, degli standard, dei controlli e del diluente A Contr. Neg. Camp1 Camp5 B Contr. Neg. Camp1 Camp5 C Cal 0.16 ppb Camp2 Camp6 D Cal 0.16 ppb Camp2 Camp6 E Cal 0.6 ppb Camp3 Camp7 F Cal 0.6 ppb Camp3 Camp7 G Cal 2.5 ppb Camp4 Camp8 H Cal 2.5 ppb Camp4 Camp Manualità operatore (precisione) Tempo dispensazione (no >10minuti) Analisi in doppio, non più di 3 strip a test o usare multicanale Fase 4: rispettare tempi di incubazione e effettuare corrette fasi di lavaggio Almeno 250 µl per ogni pozzetto Se manualmente: carta assorbente ed eliminare tutte le bolle Fase 5: substrato colorato, incubare al buio e aggiungere soluzione STOP Lettura entro 30 minuti Lettura spettrofotometrica a 450nm

8 Quantificazione Seguire le istruzioni presente in ogni kit (viene sempre riportato un esempio illustrativo della curva standard) La quantificazione avviene per confronto/estrapolazione con quest ultima %B0: rapporto tra OD (standard o campioni) e la media della OD del controllo negativo (soluzione non contente MC-LR - %B0= 100%) % CV: [(dev.st/media)*100] delle misure di OD Degli standard: mai > 10% Dei campioni: mai > 15% Se superiore il test va ripetuto %B0 vs [MC-LR] su scala semilogaritmica (evidenzia meglio il tratto lineare della curva) Partendo dall equazione della curva si calcola la x, che corrisponde al log della concentrazione Per avere una risposta proporzionale alla concentrazione, il dato deve cadere nel tratto lineare della curva standard e non agli estremi... 0,16 ppb - 2,50 ppb campione negativo Misure da ripetere dopo diluizione dei campioni Valore accettabile

9 Quando applicarli Questo metodo determina la concentrazione totale di cianotossina e non discrimina tra le molecole parentali e i coniugati che però hanno quasi sempre tossicità minore Affidabilità e sensibilità del metodo dipendono dalla natura dell anticorpo e dalla sua crossreattività con i vari congeneri e coniugati Se scarsa: poco utile, si hanno informazioni accurate su uno specifico congenere, non adatto per un test di screening Se alta: auspicabile, per sapere se un campione ambientale è o meno contaminato da cianotossine, a prescindere dal congenere, ma: SOVRASTIMA Anticorpi sviluppati su uno specifico congenere (es. per microcistine la MC-LR): reattività massima verso questa variante, mentre le altre saranno identificate con sensibilità diversa: quantificazione fatta rispetto ad una curva standard con unico congenere: SEMI-QUANTITATIVI Saggio ELISA è idoneo per analisi di SCREENING delle cianotossine Permette di avere RISPOSTE VELOCI e CAUTELATIVE Può essere usato come AZIONE DI I LIVELLO Comunque per una valutazione più accurata e precisa: usare tecniche analitiche o combinazioni di tecniche più complesse

Documenti analoghi

Mara Stefanelli. Istituto Superiore di Sanità Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria. Roma 19 maggio 2009

Mara Stefanelli. Istituto Superiore di Sanità Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria. Roma 19 maggio 2009 SORVEGLIANZA DELLE FIORITURE DI CIANOBATTERI NELLE ACQUE DI BALNEAZIONE: APPROCCIO PER L APPLICAZIONE DEL DL.vo 30 MAGGIO 2008 N.116 IN RECEPIMENTO DELLA DIRETTIVA 2006/7EC Metodi immunoenzimatici per