TECNICHE IMMUNOISTOCHIMICHE IN PATOLOGIA VETERINARIA: VANTAGGI E LIMITI. Pezzolato Marzia, DVM LAB Istopatologia - IZSTO

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1 TECNICHE IMMUNOISTOCHIMICHE IN PATOLOGIA VETERINARIA: VANTAGGI E LIMITI Pezzolato Marzia, DVM LAB Istopatologia - IZSTO

2 L immunoistochimica (IHC) serve per individuare un determinato antigene mediante l utilizzo di un anticorpo specifico.

3 IMMUNOISTOCHIMICA L IHC è una metodica: Semplice Basata su una reazione Ag-Ac Utilizzata in tutti i laboratori di anatomia patologia Si applica a sezioni di tessuto congelato o fissato ed incluso in paraffina.

4 IMMUNOISTOCHIMICA METODICA: Sparaffinatura xilolo/sostituti atossici Reidratazione tessuti scala alcolica decrescente Smascheramento antigenico termoindotto enzimatico

5 IMMUNOISTOCHIMICA Blocco delle perossidasi endogene soluzioni metanolo-perossido d idrogeno Blocco degli antigeni aspecifici sieri specifici Incubazione con anticorpo primario Ac primario anti-antigene ricercato

6 IMMUNOISTOCHIMICA Incubazione con anticorpo secondario coniugato Ac secondario biotinilato Sviluppo Applicare il complesso avidina-biotina Aggiungere il substrato cromogeno - DAB

7 IMMUNOISTOCHIMICA Incubazione con polimero molecola di destrina coniugata con Ac anti mouse/rabbit Sviluppo DAB

8 IMMUNOISTOCHIMICA Controcolorazione emallume e viraggio Disidratazione tessuti scala alcolica crescente

9 IMMUNOISTOCHIMICA Diafanizzazione xilolo/sostituti atossici Montaggio balsamo compatibile con il diafanizzante Analisi al M.O.

10 IMMUNOISTOCHIMICA Ciò che è cambiato con il tempo sono le FINALITA per cui la si applica nei diversi laboratori

11 IMMUNOISTOCHIMICA IN MEDICINA VETERINARIA Finalità: Diagnostica di patologie infettive Sicurezza alimentare Caratterizzazione neoplasie

12 1 - DIAGNOSTICA DI PATOLOGIE INFETTIVE L esame dei tessuti di origine animale può essere finalizzato alla diagnostica di patologie infettive. L IMMUNOISTOCHIMICA è utilizzata come supporto per la diagnosi di patologie infettive animali sia virali che batteriche. VIRUS E BATTERI ANIMALI SONO SPESSO FONTE DI ZOONOSI

13 1 - DIAGNOSTICA DI PATOLOGIE INFETTIVE Accurato processo di standardizzazione e validazione della metodica Gestione controllata della procedura

14 1 - DIAGNOSTICA DI PATOLOGIE INFETTIVE LIMITI: Mancanza di anticorpi specifici Reperimento di materiale sicuramente positivo Adeguato stato di conservazione dei tessuti in esame

15 1 - DIAGNOSTICA DI PATOLOGIE INFETTIVE ESEMPIO: TUBERCOLOSI BOVINA Anticorpo policlonale anti- Mycobacterium bovis Validazione: Messa a punto dell anticorpo

16 1 - DIAGNOSTICA DI PATOLOGIE INFETTIVE ESEMPIO: TUBERCOLOSI BOVINA Anticorpo policlonale anti- Mycobacterium bovis Smascheramento: 20 min. 37 C in una soluzione 20µl/ml di Proteinasi K Diluizione Ab antimycobacterium bovis diluito 1:1500

17 1 - DIAGNOSTICA DI PATOLOGIE INFETTIVE ESEMPIO: TUBERCOLOSI BOVINA Identificazione ed allestimento di sezioni da n. 52 campioni positivi all isolamento e n. 37 negativi Valutazione di sensibilità e specificità del metodo sensibilità del 67,3% (IC 95%: 54,6-80,1%) specificità del 94,6% (IC 95%: 81,8-99,33%)

18 1 - DIAGNOSTICA DI PATOLOGIE INFETTIVE ESEMPIO: TUBERCOLOSI BOVINA Confronto di sensibilità e specificità del metodo con i valori ottenuti dai metodi istochimici ZN sensibilità pari al 33,9% (IC 95%: 25,5 43,0%) specificità del 100% (IC 95%: 93,2 100,0%) Non applicabilità del metodo IHC per routine

19 1 - DIAGNOSTICA DI PATOLOGIE INFETTIVE ESEMPIO: TUBERCOLOSI BOVINA Positività su campioni negativi all isolamento per TBC e con lesioni istologiche simili (Rhodococcus equi) Negativo su lesioni classificate conclusive all istologico come non Non applicabilità del metodo IHC per routine

20 1 - DIAGNOSTICA DI PATOLOGIE INFETTIVE ESEMPIO:PCV2 IHC metodo di conferma La positività in relazione alla presenza di lesioni caratteristiche.

21 1 - DIAGNOSTICA DI PATOLOGIE INFETTIVE ESEMPIO:PCV2

22 1 - DIAGNOSTICA DI PATOLOGIE INFETTIVE ESEMPIO:PCV2

23 2 SICUREZZA ALIMENTARE L esame dei tessuti di origine animale può essere finalizzato alla sicurezza alimentare. Dal 2008 il Ministero della Salute ha incaricato i LABORATORI UFFICIALI di analizzare organi target di bovini regolarmente macellati al fine di individuare l utilizzo fraudolento di sostanze anabolizzanti.

24 2 SICUREZZA ALIMENTARE Sono iniziate ricerche finalizzate alla validazione del metodo istologico, supportato dalle indagini immunoistochimiche, per l individuazione delle lesioni indotte da trattamenti illeciti sugli animali.

25 2 SICUREZZA ALIMENTARE VANTAGGI: Questo permetterà di: garantire un miglioramento del benessere animale diminuire l utilizzo di molecole che residuando a livello dei tessuti edibili e che potrebbero comportare l insorgenza di problemi nel consumatore.

26 2 SICUREZZA ALIMENTARE Accurato processo di standardizzazione e validazione della metodica Gestione controllata della procedura

27 2 SICUREZZA ALIMENTARE LIMITI: Sperimentazione su un numero statisticamente significativo di animali per la creazione di materiale di riferimento non esistente Codifica dei quadri riferibili a trattamenti illeciti Valutazione della rispondenza del metodo alla legislazione di riferimento

28 2 SICUREZZA ALIMENTARE NORMALE:NEGATIVA METAPLASIA:SOSPETTA

29 3 CARATTERIZZAZIONE NEOPLASIE L esame dei tessuti di origine animale può essere finalizzato alla caratterizzazione di lesioni neoplastiche. Questa finalità, fondamentale per la diagnostica umana, non trova ad oggi larga applicazione nella routine diagnostica veterinaria dei laboratori ufficiali.

30 3 CARATTERIZZAZIONE NEOPLASIE Finalità diagnostica e non prognostica che questo esame assume a causa della mancanza di cultura e di strutture adeguate all associazione di diagnosi e terapia dei pazienti oncologici.

31 3 CARATTERIZZAZIONE NEOPLASIE Criticità: messa a punto di panel standardizzati da utilizzare in routine per l identificazione degli istotipi tumorali

32 3 CARATTERIZZAZIONE NEOPLASIE LIMITI: Mancanza di anticorpi specifici testati sulle specie animali Reperimento di materiale sicuramente positivo Adeguato stato di conservazione dei tessuti in esame

33 3 CARATTERIZZAZIONE NEOPLASIE: ESEMPIO Messa a punto e validazione di anticorpi CD3 e CD79 α per caratterizzazione immunofenotipica linfomi Reperimento di materiale sicuramente positivo Linfonodi Adeguato stato di conservazione dei tessuti in esame Prelievo autoptico e immediata fissazione

34 3 CARATTERIZZAZIONE NEOPLASIE: ESEMPIO

35 3 CARATTERIZZAZIONE NEOPLASIE: ESEMPIO Colorazione di 18 linfonodi con ogni Ac Valutazione sensibilità e specificità del metodo sensibilità e specificità del metodo: 100% (I.C. al 95%: %)

36 3 CARATTERIZZAZIONE NEOPLASIE: ESEMPIO CD 79α CD 3

37 TUTTI A FARE MERENDA IN SPIAGGIA?