Metodi di identificazione e quantificazione: Metodi immunoenzimatici

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1 Metodi di identificazione e quantificazione: Metodi immunoenzimatici Daniela Mattei Mara Stefanelli I CIANOBATTERI POTENZIALMENTE TOSSICI: IMPLICAZIONI SANITARIE E GESTIONE DEL RISCHIO Istituto Superiore di Sanità Roma Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria Roma 15 novembre 2007

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3 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay Principio identificazione di un particolare anticorpo mediante legame con antigene specifico evidenza del complesso antigene-anticorpo indice della presenza dell'anticorpo cercato reazione semi-quantitativa Steps Antigene (analita) adsorbito su superficie del sistema ( sorbent ). Antigene riconosciuto dall anticorpo specifico ( immuno ) Anticorpo riconosciuto da un secondo anticorpo marcato con enzima ( enzyme-linked ). Reazione enzima-substrato con produzione di un complesso, generalmente colorato intensità del segnale (risposta) semi proporzionale alla quantità di antigene (analita) inizialmente presente

4 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay Diretto antigene viene direttamente adeso alla base solida (pozzetto) seguito da un anticorpo direttamente marcato con un enzima Indiretto antigene direttamente adeso alla base solida anticorpo primario non marcato aggiunto anticorpo secondario marcato, specifico contro quello primario

5 Un tipico KIT ELISA commerciale strips, in forma di piastre da 96 pozzetti, con anticorpo adeso sul fondo Controllo negativo Calibratori a concentrazioni (in ppb) diverse Diluente Coniugato Soluzione di lavaggio Substrato Soluzione Stop

6 Alcuni saggi ELISA per la determinazione di tossine da cianobatteri Microcistine Nodularine Anatossina-a Cilindrospermopsine Saxitossine

7 Metodo ELISA competitivo per la determinazione di microcistine in campioni di acqua 1. preparazione del campione aliquota (es. 100 ml) sottoposta a congelamento/scongelamento & ultrasuoni: lisi cellulare e rilascio tossine 2. allestimento dei pozzetti: n. 2 pozzetti per ciascun campione n. 2 pozzetti per ciascun materiale di riferimento diluente in ciascun pozzetto analita standard (antigene) immobilizzato sul supporto 3. reazione di competizione: campione inserito nel pozzetto insieme ad anticorpo specifico per l analita antigene (campione) compete con l antigene immobilizzato nel legare l anticorpo incubazione (t ambiente, 30 min) lavaggio: rimozione dei complessi antigene-anticorpo in soluzione

8 Metodo ELISA competitivo per la determinazione di microcistine in campioni di acqua 4. legame del complesso marcato anticorpo-enzima: inserimento nel pozzetto di un anticorpo marcato con enzima che va a legarsi all anticorpo primario lavaggio: rimozione dei complessi in soluzione 5. reazione cromogenica: addizionato un reagente incolore che genera una reazione colorimetrica prodotta dall enzima legato al complesso antigene-anticorpo immobilizzato sul substrato incubazione (t ambiente, 30 min) reazione inibita mediante addizione di reagente acido 6. dosaggio: lettura spettrofotometrica intensità di colore inversamente proporzionale alla concentrazione di analita concentrazione incognita ottenuta per interpolazione su una funzione assorbanza/concentrazione di analita ottenuta con materiali di riferimento Conc. MC (log)

9 Vantaggi Metodo ELISA per la determinazione di microcistine disponibilità kit commerciali sensibilità (LOD ca. 0.1 μg/l) Ridotte quantità di campione (non trattato) rapidità (ca. 3 ore / > 40 campioni) accuratezza e precisione idonei allo scopo disponibilità di anticorpi specifici per apteni presenti sulla molecola di cianotossine aspecificità cross-reactivity (falsi +) costi Svantaggi

10 Conclusioni saggi ELISA e PPi metodi di screening efficaci e praticabili esperienza ISS materiali di riferimento: limitazioni di impiego costi limitati a poche tossine metodi di conferma: indispensabili per effettiva valutazione del rischio aspettative da metodi molecolari

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