Metodi biochimici che utilizzano anticorpi

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1 Metodi biochimici che utilizzano anticorpi Saggio ELISA Saggio RIA Western blot Immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione (cromatografia per affinità) Citofluorimetria a flusso Immunofluorescenza

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5 affinità antigene-anticorpo

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8 Produzione di anticorpi policlonali 1. Si inietta nel coniglio (o topo) l antigene X purificato 2. Si preleva il siero, che contiene anticorpi contro X 3. Eventualmente si purificano gli anticorpi

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10 Gli anticorpi si purificano per cromatografia

11 Produzione di anticorpi monoclonali

12 Cromatografia per affinità: Immunoprecipitazione (pull-down)

13 Cromatografia per affinità: Co-Immunoprecipitazione

14 Per rendere visibili le proteine gli anticorpi si possono legare a fluorofori o enzimi in grado di produrre reazioni luminose o colorimetriche

15 Perossidasi di rafano (luminescenza) Fosfatasi alcalina (colorimetria) Alloficocianina (fluorescenza) R-ficoeritrina (fluorescenza)

16 Saggi diretti

17 Saggi indiretti

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19 Scelta dell anticorpo secondario

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21 ELISA = Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay E usato in diagnostica, nel controllo di qualità, in tossicologia, nella ricerca etc. Consente di conoscere la quantità di un antigene (per il quale si disponga di un anticorpo) in un campione anche complesso (ad es sangue). L antigene può essere anche un anticorpo (ad es. contro virus dell epatite)

22 Tipi di ELISA diretto indiretto sandwich

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25 Vantaggi: sensibile, specifico e tecnicamente semplice Svantaggi: richiede macchinari specialistici (lettore di piastre), costo, lineare solo in un range limitato, richiede buoni controlli interni.

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27 RIA = Radio-Immuno Assay

28 (serum or cell extract) misurare radioattività (E1) misurare radioattività (E2) E1-E2= valore proporzionale alla quantità di antigene legato, quantificato tramite una curva standard

29 Ag* + Ab Ag*Ab Ag*Ab + Ag Ag*Ab + AgAb + Ag* Misura di Ag* libero Misura di Ag Vantaggi: estremamente sensibile ed estremamente specifico Svantaggi: richiede macchinari specialistici (contatore di radiazioni g), costo, potenzialmente rischioso per l operatore.

30 Impieghi del RIA in biochimica clinica: dosaggio di insulina, dosaggi ormonali, rilevazione di sostanze dopanti

31 Western blot

32 1. Preparazione del campione (ad es. omogenato di tessuto) 2. Gel elettroforesi (di solito SDS-PAGE)

33 3. Trasferimento delle proteine dal gel ad una membrana (nitrocellulosa o PVC)

34 Ponceau S staining Trasferimento non corretto

35 Immunoreazioni

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37 Detection 1. L anticorpo secondario è legato ad un enzima che produce una sostanza : Colorata Luminescente Fluorescente Sistema di visualizzazione ed analisi (densitometria)

38 ECL = Enhanced ChemiLuminescence

39 Acquisizione della luminescenza

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41 Controllo del caricamento mediante anticorpi per geni housekeeping

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43 Metodi che utilizzano anticorpi legati a fluorocromi

44 Strutture di comuni fluorocromi

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46 CITOMETRIA A FLUSSO

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49 Electrostatic Cell Sorting

50 Studio del ciclo cellulare mediante colorazione con ioduro di propidio e citometria a flusso (questo non è un metodo immunologico) Lo ioduro di propidio colora il DNA intercalandosi tra le basi fluorescenza

51 CITOMETRIA A FLUSSO Vantaggi : estremamente sensibile ed estremamente specifico Svantaggi : richiede macchinari specialistici, costo.

52 Colorazione di un tessuto o di cellule con un anticorpo primario che riconosce specificamente una proteina. Visualizzazione in microscopia a fluorescenza mediante un anticorpo secondario coniugato ad un fluorocromo Immunofluorescenza

53 L immunoistochimica consente di differenziare tipi cellulari

54 a G93A- G93A+ b c d 50mm

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56 cyt c AIF merge WT G93A

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58 Immunoistochimica in microscopia elettronica Colorazione di un tessuto o di cellule con un anticorpo primario che riconosce specificamente una proteina. Visualizzazione in microscopia elettronica mediante un anticorpo secondario coniugato a particelle di oro colloidale (elettrondense)