WESTERN BLOTTING Tecnica che permette di valutare quanto è espressa una proteina e dove è localizzata. SDS-PAGE trasferimento saturazione

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1 WESTERN BLOTTING Tecnica che permette di valutare quanto è espressa una proteina e dove è localizzata. La procedura di Western Blotting consiste nei seguenti passaggi: - SDS-PAGE - trasferimento (blotting) delle proteine dal gel ad una membrana (nitrocellulosa o PVDF) - saturazione (blocking) della membrana (latte, BSA, gelatina) - Incubazione con anticorpo primario -Incubazione con anticorpo secondario (coniugato con un tracciante) - rilevazione (detection)

2 SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis Gel Elettroforesi: separazione in un campo elettrico - il detergente anionico (-) SDS si lega alle proteine conferendo una carica omogenea negativa - il n di molecole di SDS che si legano alle proteine è circa proporzionale al n di amminoacidi che le compongono - la separazione avviene in base al peso molecolare delle proteine

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6 SOLUTIONS Tampone di trasferimento: 25 mm Tris, 0.2 M glicina, 20 % metanolo ph 8.5 Rosso Ponceau: 0.1 % in 1 % acido acetico (v/v) (può essere riusato più volte) TBS 10x: g NaCl, g Tris dissolvere in 800 ml H 2 0bd, ph 7.4 con HCl e portare a volume fino a 1L TBST (soluzione di lavaggio): TBS 1x % Tween-20 Soluzione Blocking: TBST + 5% latte non grasso

7 TRASFERIMENTO Si parte da un gel di poliacrilamide su cui hanno corso delle proteine, lo si estrae dal supporto, si taglia via la parte dello stacking gel e lo si immerge nella soluzione di trasferimento per almeno 5 minuti. Si immergono nello stesso tampone i due supporti spugnosi, i due rettangoli di carta assorbente la membrana di trasferimento viene immersa in H 2 0 bd per lo stesso tempo. Si predispone poi il sandwich di trasferimento nella cassettina in questo ordine partendo dal lato che sarà rivolto verso l'anodo (polo positivo): Spugna Carta Membrana Gel Carta Spugna Prima di porre il secondo strato di carta eliminare le bolle d'aria tra la membrana e il gel con un rullo (o una pipetta) bagnati di tampone.

8 TRASFERIMENTO Riempire l'apparato con il tampone di trasferimento. Introdurre nei binari la cassettina preparata avendo cura di rispettare le polarità; è importante infatti rivolgere la membrana di nitrocellulosa verso il polo positivo (anodo - per convenzione il cavetto è di colore rosso). Collegare gli elettrodi all'alimentatore selezionando l'opzione voltaggio costante ed impostando su 50 volt per due ore (nel caso sia necessario trasferire proteine fino a 60 KD) oppure 12 ore per proteine sopra i 100 KD. Se la cella può alloggiare un cubo di ghiaccio sintetico si possono selezionare V ed abbreviare i tempi fino a 3-4 ore a seconda delle necessità. All interno della cella viene introdotto un agitatore magnetico per equilibrare la soluzione tampone. Terminato il processo, separare la membrana ponendola in un contenitore di dimensioni appena maggiori che non abbia irregolarità sul fondo

9 TRASFERIMENTO Il trasferimento delle bande proteiche corrispondenti al marker di peso molecolare (prima linea a sinistra) conferma l avvenuto trasferimento.

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11 Preparazione della membrana Versare circa 5-10 ml di soluzione di Rosso Ponceau nella vaschetta messa su un agitatore oscillante per 5 min; recuperare il colorante e decolorare con acqua distillata fino a quando non siano visibili le bande. Questo passaggio serve per valutare l'efficienza del trasferimento, la presenza di bolle, evidenziare l'area di lavoro e le lanes corse. Queste informazioni sono utili per tagliare la membrana e ridefinire l'area utile, separare le varie lanes o verticalmente o orizzontalmente, destinando a trattamenti diversi i vari pezzi.

12 Blocking Una volta colorata la membrana immergerla nella soluzione di blocking Incubare la membrana per 30 minuti in agitazione a temperatura ambiente Incubazione con anticorpi primari e secondari Anticorpo primario Diluire l anticorpo primario nella soluzione di blocking alla concentrazione opportuna Eliminare la soluzione di blocking, aggiungere l anticorpo primario precedentemente diluito e incubare la membrana in agitazione per 1h o 2h a seconda dell anticorpo

13 Eliminare la soluzione dell anticorpo primario, aggiungere la soluzione di lavaggio, e lavare per 30 minuti in agitazione, cambiando la soluzione di lavaggio ogni 5 minuti. Diluire opportunamente l anticorpo secondario coniugato all enzima perossidasi nella soluzione di blocking. Eliminare la soluzione di blocking, aggiungere l anticorpo secondario precedentemente diluito e incubare la membrana in agitazione per 1h.

14 L anticorpo secondario può venire coniugato a: - isotopo radioattivo (es. I125) - enzima (fosfatasi alcalina, perossidasi) - fluoroforo (es. Fluoresceina, Rodamina, Teaxas Red, Cy3, Cy5, Alexa, ) - biotina Metodi di rilevazione

15 SUBSTRATO: 3, 3 - DIAMINOBENZIDINA La DAB forma un precipitato marrone scuro/nero in presenza di perossidasi e anticorpi HRP. La DAB si prepara sciogliendo 80 mg di sostanza in 2 ml di H 2 O bidistillata, per avere una concentrazione finale di DAB pari a 10 mg in 250 ul di H 2 O. SOLUTIONE DAB 1.5 ml Tris-HCl 1M (conc.finale 50 mm) ph ml NaCl 5M (conc. finale 0.15 M) 24 ul H 2 O 2 30% 500 ul di DAB Portare a volume finale di 30 ml con H 2 0 bd

16 Reazione di ossidoriduzione Per azione della perossidasi contenuta, la DAB si riduce formando un precipitato di colore giallo-bruno: Perossidasi + H 2 O 2 + H 2 O DAB ossidato DAB ridotto

17 Incubazione Substrato Eliminare la soluzione dell anticorpo secondario, aggiungere la soluzione di lavaggio, lavare per 30 minuti in agitazione, cambiando la soluzione ogni 5 minuti. Aggiungere la soluzione con la DAB e incubare la membrana per 10/15 minuti, fino alla comparsa delle bande d interesse.