ESERCIZI 2. Spiegare il principio di.

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1 ESERCIZI 2 Spiegare il principio di.

2 Esercizio n.1 Trovare la concentrazione di NAD e NADH in una soluzione miscelata basandosi sui seguenti dati ottenuti in una cuvetta da 1 cm : I coefficienti di estinzione molare a 260 nm sono 1.5 x 10 4 per il NADH e 1.84 x 10 4 per il NAD. A 340 nm solo il NADH assorbe con ε di 6.22 x La soluzione miscelata dà assorbanze di 1,36 e 0,382 a 260 e 340 nm, rispettivamente.

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4 Trasmittanza = T=I/I 0 Assorbanza = A=log1/T = log I 0 /I Assorbanza = A = cd

5 A 260nm = 1.36 A 340 nm = ε 260 nm ε 340 nm NADH 1.5 x x 10 3 NAD 1.84 x A 340 nm A = c [NADH] = : 6.22 x 10 3 = x 10-6 M A 260 nm A = A NAD + A NADH 1.36 = [NAD] x 1.84 x [NADH] x 1.5 x 10 4 [NAD] = [1.36 (61.41 x 10-6 M x 1.5 x 10 4 )] : 1.84 x 10 4 = = [ ] : 1.84 x 10 4 = 2.4 x 10-5 M

6 Esercizio n.2 Il citocromo c è caratterizzato dai seguenti coefficienti di estinzione molare: ε 280 = e ε 415 = mol-1cm-1. Una soluzione di citocromo c in una cuvetta da 1 ml assorbe 0.17 a 280 nm e 0.4 a 415 nm. 1. Calcolare la concentrazione della proteina 2. Perché i valori ottenuti utilizzando i due coefficienti non sono uguali? 3. Se il citocromo c pesa dalton, quanti mg di proteina sono presenti in 1 ml?

7 Il citocromo c è caratterizzato dai seguenti coefficienti di estinzione molare: ε 280 = e ε 415 = mol -1 cm -1. Una soluzione di citocromo c in una cuvetta da 1 ml assorbe 0.17 a 280 nm e 0.4 a 415 nm. 1. Calcolare la concentrazione della proteina A = c c 1 = 0,17 : 2,85 x 10 4 = 5,96 x 10-6 M c 2 = 0,40 : 9,63 x 10 4 = 4,15 x 10-6 M

8 c 1 = 0,17 : 2,85 x 10 4 = 5,96 x 10-6 M (280nm) c 2 = 0,40 : 9,63 x 10 4 = 4,15 x 10-6 M (415 nm) 2. Perchè i valori ottenuti utilizzando i due coefficienti non sono uguali? Perché A 415 dipende dalla concentrazione dell eme. Evidentemente una parte del citocromo nella miscela è apo

9 3. Se il citocromo c pesa dalton, quanti mg di proteina sono presenti in 1 ml? c 1 = 5,96 x 10-6 M (280nm) c = mol/1l = g/pm/l g/l = c x pm= 5,96 x 10-6 M x 1,23 x 10 4 l= 7,331 x 10-2 g/l 7,331 x 10-2 g/l = 7,331 x 10-2 mg/ml

10 Esercizio n.4 Dai seguenti dati sperimentali ottenuti con il metodo di Lowry usando uno standard di BSA determinare la concentrazione molare di una proteina X di PM Da. 5 l 10 l 20 l 40 l 60 l BSA 1 mg/ml Proteina X diluito 1:

11 1. Costruzione del grafico Standard BSA Campione x A g in 5 l 5,4 mg/ml 57 g in 10 l 5,7 mg/ml g BSA

12 2. Determinazione concentrazione molare (PM Da) 27 g in 5 l 5,4 mg/ml 57 g in 10 l 5,7 mg/ml (5,4 + 5,7) : 2 = 5,55 g/l Poichè era diluito 1:10 55,5 g/l 1 M = 10 4 g/l c = 5,55 x 10-3 M

13 Esercizio n 4 Supponete di analizzare tramite SDS-PAGE una proteina altamente purificata il cui peso molecolare determinato tramite gel filtrazione sia pari a circa Dalton. L analisi elettroforetica, dopo denaturazione del campione in presenza di ditiotreitolo, evidenzia la presenza di tre catene polipeptidiche di massa molecolare pari a circa 27000, e Da, rispettivamente. Lo stesso campione analizzato in seguito a denaturazione in assenza di agenti riducenti evidenzia due bande di peso pari a circa e Da, rispettivamente. Quale potrebbe essere la struttura quaternaria della proteina e come sono unite tra loro le diverse subunità?

14 PM totale Da. denaturazione + DTT 27000, 13000, Da denaturazione DTT 40000, Da Quale potrebbe essere la struttura quaternaria della proteina e come sono unite tra loro le diverse subunità? S S S S S S

15 Esercizio n 5 E stata misurata la velocità iniziale di una reazione enzimatica in funzione della concentrazione di substrato ed in presenza o assenza di un inibitore, ottenendo i seguenti dati sperimentali: [S] V 0 - Inibitore + Inibitore ,30 17, ,03 22, ,5 29, ,4 45,45 a) Determinare la V max e la K m in assenza dell inibitore b) Di che tipo di inibitore si tratta? Perché?

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17 1. Costruire grafico doppi reciproci 1/ V o /[S] 1/V 0 - Inibitore + Inibitore ,033 0, ,027 0, , , / V MAX V MAX = 1/0,009 = 111 K M = 1/3 = 0,33 mol/l Inibitore competitivo - 1/K M /[S]

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19 Esercizio n 6 Completare la seguente tabella, che riassume i dati del procedimento di una purificazione di un enzima ricombinante X Step Proteina totale (mg) Attività X (Unità) Attività specifica (Unità/mg prot) Resa % Estratto grezzo Precipitazione Solf.ammonio x 10 5 Cromatografia Gel filtrazione x 10 5 FPLC Scambio ionico 60 6 x 10 5 Purificazione Calcolare dopo ogni tappa della procedura di purificazione: a) l attività specifica (unità/mg) della soluzione enzimatica; b) la resa dell enzima; c) il livello di purificazione dell enzima (è una misura di quanto aumenta l attività specifica nei vari passaggi).

20 Attività specifica = unità totali di enzima quantita di proteine totali Livello di purificazione = attività spec. recuperata/mg attività spec. iniziale/mg Resa % = quantità di proteina purificata quantità di proteina nell estratto iniziale

21 Esercizio n 6 Completare la seguente tabella, che riassume i dati del procedimento di una purificazione di un enzima ricombinante X Step Proteina totale (mg) Attività X (Unità) Attività specifica (Unità/mg prot) Resa % Estratto grezzo Precipitazione 2 x Solf.ammonio x 10 5 Cromatografia 5 x ,4 50 Gel filtrazione x 10 5 FPLC ,6 100 Scambio ionico 60 6 x 10 5 Purificazione Calcolare dopo ogni tappa della procedura di purificazione: a) l attività specifica (unità/mg) della soluzione enzimatica; b) la resa dell enzima; c) il livello di purificazione dell enzima (è una misura di quanto aumenta l attività specifica nei vari passaggi).

22 Esercizio n 7 Determinare il peso molecolare approssimativo di una proteina che eluisce da una colonna cromatografica per gel filtrazione (eluita a flusso costante) con tempo di ritenzione t R = 38 min, sulla base dei seguenti dati sperimentali su proteine utilizzate come standard: PM proteina (Da) t R (min)

23 Esiste una proporzionalità inversa tra volume di eluizione e massa molecolare Si può costriuire una curva di calibarzione per determinare il peso di una proteina sarebbe il volume di eluizione relativo: Ve/Vo

24 T r (min) Log PM proteina t R (min) 4, , , , ,11 60 T r x = 38 min Log M R x = 4,4 PM x = Da 10 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 Log M R

25 Esercizio n 8 Quali proprietà molecolari delle proteine vengono sfruttate dalle seguenti tecniche di separazione : Elettroforesi denaturante Carica Peso molecolare Punto isoelettrico Specificità Altro (specificare)

26 Esercizio n 9 Descrivere schematicamente il procedimento per fare X a Y. La tecnica X si usa per Pertanto per analizzare Y. Bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla bla.. NO! 1. Reazione di x con y 2. Legame del prodotto con z 3. Incubazione. 4. Denaturazione 5. Recupero. SI Reazione di x con y Legame del prodotto con z Incubazione. Denaturazione Recupero. SI