TECNICHE SPETTROSCOPICHE

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1 TECNICHE SPETTROSCOPICHE

2 L interazione delle radiazioni elettromagnetiche con la materia e essenzialmente un fenomeno quantico, che dipende sia dalle proprieta della radiazione sia dalla natura della materia stessa. La conoscenza delle proprieta delle radiazioni elettromagnetiche e della loro interazione con la materia permette di riconoscere diversi tipi di spettri e diverse tecniche spettroscopiche e la loro applicazione alla soluzione di problemi di natura biologica.

3 INTERAZIONE DELLE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE E DI VARIE PARTI O STRUTTURE DELLA MATERIA FENOMENO REGIONE DELLO SPETTRO LUNGHEZZA D ONDA Nucleare Gamma 0.1 nm Elettroni interni Raggi X nm Ionizzazione Ultravioletto nm Elettroni di valenza Vibrazioni molecolari Rotazione e orientamento dello spin elettronico in campi magnetici Orientamento dello spin nucleare in campi magnetici Ultravioletto vicino al visibile Infrarosso vicino e infrarosso Microonde Onde radio nm mm 400 mm 30 cm 100 cm e oltre

4 L energia, la frequenza, la lunghezza d onda e l intensita sono proprieta dei fenomeni elettromagnetici. Nel loro insieme possono essere spiegati considerando gli spettri elettronici.

5 LO SPETTRO ELETTROMAGNETICO E LE CARATTERISTICHE SPETTRALI DEI COMPONENTI DELLO SPETTROFOTOMETRO

6 Gli elettroni di un atomo possono essere distribuiti su diversi livelli elettronici. Affinche un elettrone possa passare ad un livello energetico superiore deve essere fornita energia; se l energia deriva da una radiazione elettromagnetica, si avra un assorbimento con un suo spettro tipico. Quando un elettrone torna al livello energetico iniziale, il sistema emette un quanto di energia, dando origine ad un emissione con uno spettro caratteristico.

7 LIVELLI ENERGETICI E TRANSIZIONI ELETTRONICHE a) In un atomo di sodio b) In una molecola organica

8 Per una transizione elettronica, il cambiamento energetico viene definito in termini quantitativi dalla relazione seguente: E = E 1 E 2 = h [1] dove E e la variazione nel livello energetico dell elettrone o l energia della radiazione elettromagnetica assorbita o emessa da un atomo o da una molecola; E 1 /E 2 è l energia dell elettrone a livello iniziale/finale, rispettivamente; h e la costante di Planck ( 6,63x10-34 Js) e la frequenza della radiazione elettromagnetica, in hertz (c/ ) c e la velocita della luce ( 3x10 8 ms -1 ) e la lunghezza d onda della radiazione (1/v) v e il numero d onda della radiazione, in onde cm -1 (kayser)

9 SPETTROSCOPIE NELL ULTRAVIOLETTO E NEL VISIBILE Sono le tecniche piu utilizzate nel lavoro analitico di routine e nella ricerca biomedica.

10 PRINCIPI TEORICI TRASMITTANZA T = I/I 0 [2] dove I 0 e l intensita della radiazione incidente I e l intesita della radiazione trasmessa

11 ASSORBANZA (A) o ESTINZIONE (E) A = E = log (1/T) = log (I 0 /I) [3] LEGGE DI LAMBERT-BEER A = cd [4] dove e il coefficiente di estinzione molare della sostanza che assorbe la luce ad una lunghezza d onda (dm 3 mol -1 cm -1 ) c e la concentrazione molare della soluzione che assorbe la luce d e il cammino ottico della radiazione nella soluzione (cm)

12 STRUMENTAZIONE Spettrofotometro a singolo raggio Spettrofotometro a doppio raggio

13 Saggi colorimetrici di comune impiego

14 TIPI DI SPETTRO Spettro assoluto: e lo spettro di assorbimento ad una determinata lunghezza d onda Spettro differenziale: e la differenza tra due spettri di assorbimento

15 Gli spettri sono grafici dell assorbanza in funzione della lunghezza d onda Spettro assoluto di assorbimento del citocromo c ridotto

16 APPLICAZIONI a) Spettro assoluto dell ubichinone e dell ubichinolo b) Spettro differenziale dell ubichinone e dell ubichinolo

17 SPETTROFLUORIMETRIA La fluorescenza e un fenomeno di emissione, in cui viene misurata la transizione all interno della molecola da un livello energetico superiore ad uno inferiore, rilevando la radiazione emessa, anziche quella assorbita.

18 Un fenomeno associato alla fluorescenza e la fosforescenza, ma in questo caso l emissione ha tempi di decadimento maggiori ed in genere permane anche quando l energia di eccitazione non e piu applicata. A basse concentrazioni e valida la seguente relazione tra intensita di fluorescenza (I f ) e radiazione incidente (I 0 ): I f = 2.3 I 0 cdq dove Q e l efficienza quantica c e la concentrazione molare della soluzione fluorescente (M) d e il percorso ottico della soluzione fluorescente (cm) e il coefficiente di estinzione molare della sostanza che assorbe la luce ad una lunghezza d onda (dm 3 mol -1 cm -1 )

19 STRUMENTAZIONE Componenti principali di uno spettrofluorimetro con illuminazione a 90

20 STRUMENTAZIONE Attenuazione degli effetti filtro : a) usando microcuvette b) con illuminazione frontale

21 STRUTTURA DI ALCUNE SONDE FLUORESCENTI

22 APPLICAZIONI Identificazione della struttura di una sostanza Identificazione degli effetti del ph, del solvente e della polarizzazione della fluorescenza

23 DOSAGGI ENZIMATICI E CINETICI Per i dosaggi enzimatici e possibile utilizzare analisi spettrofluorimetrica. Un esempio e l utilizzo dell anione del 4-metilumbelliferone a) Spettri di assorbimento b) Spettri di fluorescenza

24 SPETTROSCOPIA IN DICROISMO CIRCOLARE (CD) Questa tecnica fornisce informazioni sulla struttura tridimensionale delle macromolecole contenenti centri chirali. Il parametro misurato nella spettroscopia CD e l ellitticita ( ): = E (180/4 ) = 33 E gradi [6] dove E e la differenza in estinzione per le onde R e L

25 COMPONENTI PRINCIPALI DI UNO SPETTROFOTOMETRO CD

26 LUMINOMETRIA E la tecnica impiegata per misurare la luminescenza, che e il risultato di una reazione chimica

27 STRUMENTAZIONE Schema dei componenti principali di un semplice luminometro

28 SPETTROFOTOMETRIA DI FIAMMA E DI ASSORBIMENTO ATOMICO L emissione della luce viene misurata mediante la spettrofotometria ad emissione di fiamma, mentre l assorbimento viene misurato dalla spettrofotometria di fiamma ad assorbimento atomico

29 STRUMENTAZIONE Schema dei componenti principali di uno spettrofotometro di fiamma ad emissione atomica

30 APPLICAZIONI DELLE SPETTROSCOPIE ATOMICHE A FIAMMA Queste tecniche sono largamente usate nei laboratori clinici, per determinare i metalli nei fluidi corporei. Queste determinazioni aiutano nella diagnosi e nel monitoraggio di molti regimi terapeutici.

31 Limiti di sensibilita per diversi elementi in spettrofotometria di emissione ed assorbimento di fiamma, in spettrofotometria di assorbimento senza fiamma e con elettrodi iono-selettivi

32 SPETTROMETRIA DI RISONANZA DI SPIN ELETTRONICO (ESR) Il quanto di energia richiesto per causare la condizione di risonanza e la transizione tra gli stati energetici puo essere quantificato come: dove h = g H [7] h e la costante di Planck (6,63x10-34 Js) e la frequenza della radiazione applicata g e il fattore spettroscopico di separazione (splitting) e il momento magnetico dell elettrone ( magnetone di Bohr) H e l intensita del campo esterno applicato

33 STRUMENTAZIONE Componenti principali di uno spettrometro di risonanza di spin elettronico

34 Spettri di risonanza di spin elettronico: a) Grafico di assorbanza (A) in funzione della forza del campo (H) b) Grafico della derivata prima di A (da/dh) in funzione di H

35 SPETTROMETRIA DI MASSA Per usare la spettrometria di massa, al fine di identificare diverse strutture chimiche, è necessario eseguire un tipo di esperimento che causa la disintegrazione dell entita molecolare, con conseguente produzione di frammenti ionici, ognuno dei quali e rappresentato da un picco nello spettro risultante

36 STRUMENTAZIONE Componenti principali di uno spettrometro di massa

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