Capitolo 10: Spettroscopia. Spettroscopia: interazione tra molecole e radiazione elettromagnetica

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1 Capitolo 10: Spettroscopia Spettroscopia: interazione tra molecole e radiazione elettromagnetica H O H 1

2 Dalla descrizione secondo Maxwell (1864) dei fenomeni elettromagnetici: radiazione elettromagnetica = campi elettrici e magnetici che si propagano come un onda nello spazio Onda piana, polarizzata, monocromatica che si propaga lungo la direzione x Campi elettrico e magnetico ortogonali alla direzione di propagazione 2π E (, ) z x t = E0 cos ( x ct) λ E 0 : Intensità del campo elettrico 2

3 2π E (,0) z x = E0 cos x λ λ: lunghezza d onda E z 0 λ t = 0 x c = E z 10 8 m/s ( km/s) : velocità di propagazione della radiazione (luce) nel vuoto, indipendente da λ t = 0 0 x = c t t = t Radiazioni monocromatiche catalogabili secondo la lunghezza d onda 1µ m = 10 m 1nm = 10 m x 1pm = Angstrom = 0.1nm = m m 3

4 Radiazione monocromatica (ad un solo colore): una sola lunghezza d onda! Radiazione non monocromatica: sovrapposizione di campi elettrici dovuti a radiazioni con diversa lunghezza d onda 4

5 Campo elettrico come funzione del tempo a x = 0 2π Ez ( 0, t) = E0 cos ct λ E z 0 T t Periodo dell oscillazione: Frequenza: 1 ν T T λ / c c = (in Hertz, λ Hz 1/s) ν λ 1 1 Numero d onda: ν (spesso in cm ) ν = cν λ, ν, ν : parametri alternativi per catalogare la radiazione monocromatica λ ν, ν =? Esempio: = 5000 Angstrom 5

6 La radiazione elettromagnetica trasporta energia! I Intensità della radiazione: flusso di energia attraverso una superficie ortogonale alla direzione di propagazione, per unità di superficie e di tempo I esprimibile come J/m 2 s J = Joule, unità di misura dell' energia! E Elettromagnetismo classico (Maxwell): 0 e quindi l intensità della radiazione può essere variata in modo continuo Planck (1900) ed Einstein (1905): energia della radiazione quantizzata secondo fotoni, ciascuno con energia: E = hv Costante di Planck: h = Js I hv Ne consegue che = energia di un fotone ( ) numero di fotoni che attraversano la superficie unitaria (ortogonale alla direzione di propagazione) nell unità di tempo. I 2 6

7 Intensità della radiazione solare che arriva sulla Terra in funzione della lunghezza d onda. 7

8 La radiazione elettromagnetica viene assorbita/emessa solo se l energia di un suo fotone è pari alla differenza di energia tra due stati della molecola in esame: Energia E n hν = E n E m = E hν E m La condizione hν = E non è sufficiente perché si abbia assorbimento o emissione: devono essere rispettate anche le regole di selezione dettate dall interazione radiazione-molecola nella transizione Le varie spettroscopie si differenziano per la natura dei due stati coinvolti nella interazione con la radiazione 8

9 Misura dell assorbimento di radiazione su un campione con un spettrofotometro (rudimentale) Monocromatore (prisma o reticolo) I 0 I campione rivelatore fenditura lampada fenditura : radiazione monocromatica con lunghezza d onda λ Frazione di fotoni trasmessi (non assorbiti): Trasmittanza % T 100T = 100 I / I Trasmittanza percentuale: 0 % T 100 : trasmittanza totale = assorbimento nullo % T 0 : trasmittanza nulla = assorbimento totale Spettri di assorbimento: % T come funzione di λ (o ν, o ν ) T I / I 0 9

10 Chimica Fisica Biologica A.A Esempio di uno spettro in trasmittanza: acetato di metile %T λ / µm -1 ν / cm 10

11 Assorbimento misurato dall assorbanza (adimensionale) I I = < I I 0 0 : : ( λ) ( λ) A I log 10 T = log10 = log I 0 A 10 0 T = 1 0 T < 1 A = 0 A > 0 I I ( λ ) ( λ) Spettri di assorbimento: come funzione di (o, o ) A λ ν ν 11

12 Esempio di uno spettro di assorbimento nella scala di Assorbanza: Clorofilla a disciolta in acqua il verde non viene assorbito 12

13 Caso particolare di un soluto disciolto in un solvente che non assorbe la radiazione (in un dato campo di frequenze): legge di Lambert-Beer l A ( λ ) = ε ( λ) : percorso ottico = distanza percorsa dalla radiazione nel campione (normalmente misurato in cm) c : concentrazione (moli/litro) ε (λ) l c : coefficiente di estinzione molare (litro/moli cm), dipende dalla lunghezza d onda, ma non dalla concentrazione (o da ) l Nota: se le concentrazioni sono espresse come moli/cm, allora 2 ha dimensioni cm /moli 3 ε (λ) 13

14 Chimica Fisica Biologica A.A I 0 campione I (x) 0 l x I 0 0 Per x = l : di ( x) dx x di ( x) dx : tasso di diminuzione (nello spazio) del numero di fotoni di ( x) = KcI ( x) K: costante di prop. dx 1 di ( x) d ln I ( x) Kc = = I( x) dx dx ln I ( x) a + bx = ln I Kcx = 0 0 ln I ( l) = ln I0 Kcl Kcl = ln I0 ln I ( l) = ln I ( l ) A I 1 I K I ( l) 2.3 I ( l) = log10 = ln = ε cl I 14

15 SPETTROSCOPIA VIBRAZIONALE Consideriamo prima molecole biatomiche A-B nel loro stato elettronico fondamentale V(r): Potenziale vibrazionale: energia (potenziale) della molecola in funzione della distanza interatomica r V(r) r A B 0 r e r r e : Distanza di equilibrio D e D e : Energia di dissociazione della molecola A-B (descrive la forza del legame tra i due atomi) 15

16 Approssimazione armonica del potenziale vibrazionale 2 V( r) = D + k( r ) /2 k : costante di forza (determinata dalla V(r) e r e r curvatura nel minimo del potenziale vero ) dv ( r) F = = k( r re ) dr approssimazione armonica Modello meccanico del potenziale armonico: due masse trattenute da una molla. 16

17 Relazione diretta tra forza di legame ( ) e costante di forza ( ) D e k V(r) De '> De k' > k 0 D e k' k r D e ' 17

18 µ : massa ridotta per il moto relativo dei due atomi A e B mamb µ = = + m + m µ m m A B A B Esempi: H-H: H-Cl: µ = m m H H /2 << m Cl µ = m H mcl m + m Cl H m H Effetto dell atomo leggero: µ m se m << m A A B 18

19 Moto armonico classico secondo l equazione di Newton 2 d x( t) µ = kx x r r (scostamento dal punto di equilibrio) 2 e dt x( t) = x cos(2 πν t + α ) : moto oscillator io con frequenza ν max vib 0 1 ν vib k / µ 2π : frequenza vibrazionale classica vib E V(x) Energia dell oscillatore armonico classico (riferita al minimo dell energia): 2 E = kx max / 2 può essere variata con continuità x x max 19

20 ν ν vib vib/ c vib Le frequenze vibrazionali sono comprese nel campo IR della radiazione! 20

21 Analisi secondo la Meccanica Quantistica (eq. di Schroedinger) dell oscillatore armonico: le energie sono quantizzate! energia E n = ( n + 1/ 2) hν vib n : numero quantico vibrazionale ( n = 0,1,2,3 L) Energie permesse ν vib: frequenza vibrazionale classica I livelli energetici vibrazionali sono equidistanziati secondo hν vib x 21

22 In condizioni ordinarie solo gli stati vibrazionali fondamentali sono significativamente popolati! Transizioni vibrazionali potenzialmente osservabili: con assorbimento di fotoni con energia: E 0 E n ν = ( E E ) 0 / h= nν n Ma bisogna tener conto delle regole di selezione (ottenibili dalla descrizione quanto-meccanica dell interazione della molecola in uno stato vibrazionale con il campo elettrico della radiazione) Regola di selezione generale (non solo per molecole biatomiche): una transizione vibrazionale può avvenire solo se il momento di dipolo (elettrico) molecolare cambia durante la vibrazione ( in tal caso: vibrazione IR attiva ) Vettore momento di dipolo elettrico di due cariche opposte nello spazio q µ r µ r d q µ r =qd vib 22

23 Le molecole biatomiche eteronucleari (ad esempio HCl) posseggono un momento di dipolo derivante dalla polarizzazione del legame dovuto alla differente elettronegatività degli atomi δq H δq r Cl µ =δqr( t) µ r oscilla con la vibrazione della molecola: può effettuare transizioni vibrazionali Le molecole biatomiche omonucleari (ad esempio H 2) hanno momento di dipolo nullo, e quindi non possono effettuare transizioni vibrazionali per assorbimento di un fotone: assenza di assorbimento nell infrarosso. 23

24 Regola di selezione specifica (per molecole biatomiche): la radiazione può effettuare transizioni solo tra stati vibrazionali contigui ( ) n=±1 Transizioni vibrazionali osservate in molecole biatomiche eteronucleari: E con assorbimento di fotoni di energia: ν = ( E E ) 0 / h= ν 0 E 1 Nel caso di molecole biatomiche eteronucleari si può determinare la frequenza di vibrazione molecolare ν vib attraverso la misura della frequenza di assorbimento 1 vib 24

25 Molecole poliatomiche, ad esempio l acqua r H O ϑ Nel moto vibrazionale possono variare tre coordinate interne: due distanze di legame ed un angolo di legame. H Modi normali di vibrazione: tutte le coordinate interne (e quindi le posizioni degli atomi) oscillano con la stessa frequenza (vibrazionale). Le molecole poliatomiche posseggono diversi modi normali caratterizzati da frequenze di vibrazione in generale diverse. Nello spettro di assorbimento si osserva la transizione stato fondamentale primo stato eccitato di ogni modo normale alla propria frequenza vibrazionale, se questo è attivo all IR (vale a dire se produce un momento di dipolo oscillante) r' 25

26 La molecola d acqua presenta tre modi normali detti stretching (stiramento, cioè allungamento/accorciamento di legami) simmetrico ed antisimmetrico, e bending (piegamento molecolare dovuto a variazioni dell angolo di legame). Tutti e tre i modi normali sono attivi all IR. Rappresentazione a baricentro fisso dei modi normali Stiramento simmetrico Piegamento Stiramento antisimmetrico 26

27 Spettro IR dell acqua (liquida) Le bande vibrazionali hanno una larghezza finita a causa del moto rotazionale e delle interazioni intermolecolari che producono una distribuzione delle energie di transizione E ) ( 1 E0 27

28 Quanti sono i modi normali in una molecola non lineare con N atomi? m : n gradi di libertà = n coordinate per descrivere l e posizioni atomiche t m= 3N m : n gradi di libertà traslazionali della molecola nel lo stato di equilibrio m t =3 m r : n gradi di libertà rotazionali della molecola nell o stato di equilibrio m r =3 M = m m m = 3N 6 : n gradi di libertà vibrazionali della molecola= t r = n modi normali Esempio della molecola (non lineare) d acqua (N=3): M= = 3 28

29 Spettro IR del Bromuro di propile (N=11): M = = 27 Spettro 29

30 Spettro IR del propil benzene (N=21): M = = 57 30

31 Le tipiche molecole organiche hanno molti modi normali di vibrazione che determinano uno spettro IR di forma complicata con parecchie bande di assorbimento Esistono però dei modi che coinvolgono (piccoli) gruppi di atomi e che sono caratterizzati da frequenze di vibrazione similari indipendentemente dall intorno molecolare. Esse sono tabulate come frequenze di gruppo, e sono molto utili per la identificazione di strutture molecolari attraverso la spettroscopia IR 31

32 Spettroscopia UV-VIS (elettronica) Spettri UV-VIS prodotti da transizioni tra orbitali molecolari degli elettroni. Le transizioni che richiedono minore energia coinvolgono gli orbitali chiamati HOMO e LUMO: HOMO = highest occupied molecular orbital LUMO = lowest unoccupied molecular orbital Energia Assorbimento di un fotone UV-VIS da parte di una molecola: promozione di un elettrone dall HOMO al LUMO. hν LUMO HOMO 32

33 Stati di Singoletto e di Tripletto Gli elettroni possono avere spin +1/2 (α) o spin -1/2 (β). In un orbitale (atomico o molecolare) ci possono essere al massimo due elettroni con spin opposto. Per due elettroni su due orbitali diversi si può avere: Stati di Singoletto S: i due elettroni più esterni hanno spin antiparallelo quindi lo spin totale è nullo. LUMO HOMO Stati di Tripletto T: i due elettroni più esterni hanno spin parallelo quindi lo spin totale è pari ad 1. LUMO HOMO 33

34 Il passaggio da Singoletto a Tripletto non può essere indotto da assorbimento di radiazione, che non è in grado di cambiare lo stato di spin degli elettroni. Regola di selezione per le transizioni elettroniche : S 0 S n Lo stato fondamentale nella maggioranza delle molecole è Singoletto indicato come S 0. un L assorbimento di radiazione porta dallo stato fondamentale S 0 ad uno stato eccitato di singoletto S n. S 0 S 1 S 2 LUMO HOMO hν LUMO HOMO 34

35 In ogni stato elettronico, sia fondamentale che eccitato, esistono diversi livelli vibrazionali. Quindi le transizioni elettroniche sono accompagnate da transizioni vibrazionali (transizioni vibroniche o vibro-elettroniche) Molecola biatomica Molecola generica Energia Stato Eccitato S 1 ν 0 ν 1 ν 2 Stato Fondamentale S 0 S 1 0 r S 0 35

36 Le bande di assorbimento sono la somma di picchi corrispondenti a transizioni dallo stato fondamentale a diversi livelli vibrazionali dello stato eccitato. ν 2 ν 1 ν 0 Struttura vibrazionale risolta solo se le bande vibrazionali sono sufficientemente strette. Spettro di assorbimento con una unica banda per una data transizione elettronica, se le componenti vibrazionali hanno bande molto larghe. 36

37 Gran parte delle sostanze hanno transizioni elettroniche (vibroniche) nell ultravioletto, e quindi appaiono trasparenti nel visibile (caso dell acqua, o dell acetone). In caso di doppi legami coniugati o sistemi aromatici l assorbimento si sposta verso lunghezze d onda maggiori Se si passa da assorbimento dall UV ad assorbimento nel visibile si ha una sostanza colorata (es: caroteni, clorofille) Spettro di assorbimento del -carotene ε (l mol -1 cm -1 ) S S S S Lunghezza d'onda (nm) β-carotene 37

38 Spettro di assorbimento della Clorofilla a disciolta in acqua il verde non viene assorbito 38

39 Spettri di assorbimento UV dei principali amminoacidi aromatici (non assorbano nel visibile!) Triptofano (Trp) Fenilalanina (Phe) ε 280 (Trp) = 5690 litro / mol cm ε 280 (Tyr) = 1280 litro / mol cm ε 280 (Phe) = 160 litro / mol cm Tirosina (Tyr) 39

40 Evoluzione degli stati eccitati Lo stato eccitato a minor energia che si ottiene per assorbimento di luce è il singoletto S 1. Gli altri stati eccitati di singoletto ad energia maggiore sono indicati con S 2, S 3, energia S 3 S 2 S 1 IC Dagli stati S 2,S 3,.. si ha un rapido decadimento non radioattivo allo stato S 1 in tempi di circa s S 0 hν IC = Internal Conversion: energia in eccesso dissipata come energia termica del solvente circostante. 40

41 Lo stato S 1 ha tempi di vita variabili ma tipicamente di nanosecondi, e può deadere secondo diversi processi: energia S 3 1) Decadimento IC allo stato fondamentale S 0, senza emissione di radiazione ( decadimento non radiativo ). S 2 S 1 IC S 0 41

42 energia S 3 S 2 S 1 2) Il decadimento ad S 0 con emissione di luce. Questo fenomeno viene detto Fluorescenza. F S 0 42

43 energia S 3 S 2 S 1 ISC 3) La conversione ISC (Inter System Crossing) ad uno stato di tripletto T 1. Lo stato T 1 a sua volta può decadere non radiativamente ad S 0 o con emissione di un fotone, processo detto: S 0 P T 1 Fosforescenza (P). I tempi di vita di T 1 sono molto lunghi (da microsecondi a secondi o minuti) a causa della transizione proibita 43

44 Rappresentazione schematica degli stati e dei processi coinvolti nei processi di assorbimento / emissione / decadimento Diagramma di Jablonski S 3 S 2 IC S 1 ISC T 1 A IC F P S 0 44

45 Fluorescenza La fluorescenza avviene sempre a lunghezze d onda uguali o maggiori dell assorbimento.si può osservare struttura vibronica anche nella fluorescenza S 3 S 2 S 1 A S 0 45

46 Si definisce la resa quantica di fluorescenza come il rapporto tra il numero di fotoni emessi ed il numero di fotoni assorbiti Φ fl = nr. fotoni emessi nr. fotoni assorbiti è un numero compreso tra 0 e 1 I principali fluorofori biologici intrinseci sono gli amminoacidi aromatici, in particolare tirosina e triptofano. Le basi degli acidi nucleici sono pochissimo fluorescenti. Sono fluorescenti alcuni coenzimi come NADH, FAD e FMN. H 2 O, ph = 7 46

47 Schema di una spettrometro di fluorescenza UV-VIS (fluorimetro) Sorgente Monocromatore di eccitazione (prisma, reticolo) Rivelatore di intensità luminosa (tubo fotomoltiplicatore) Campione Monocromatore di emissione (prisma, reticolo) 47