+ (ph < pi) 0/- (ph pi)

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1 Pianificare la separazione delle seguenti proteine utilizzando una colonna cromatografica contenente lo scambiatore di cationi CM-cellulosa. A quale valore di ph dobbiamo equilibrare la FS? Stabilire la carica di ciascuna proteina nelle condizioni prescelte pi Emoglobina 7,1 Citocromo c 10,6 Fibrinogeno 5,8 Ribonucleasi 7,8 Lisozima 11,0 carica + (ph < pi) + (ph < pi) 0/- (ph pi) + (ph < pi) + (ph < pi) Aumento Forza In quali condizioni sperimentali possiamo eluire le proteine?. ionica ([NaCl]) Ipotizzare il grafico di eluizione corrispondente ph = 6.0

2 Ass (276 nm) Si legano e devono essere eluite in modo differenziale Non si lega FIBRINOGENO pi 5.8 Hb pi 7.1 Ribonucleasi pi 7.8 Citocromo C pi 10.6 Lisozima pi 11.0 Aumento della [NaCl] nella fase mobile T. el. (min) V 0

3 Scegliere le condizioni sperimentali più opportune per purificare le seguenti proteine a partire da una miscela contenente: pi PM (kda) Emoglobina Albumina Ribonucleasi Lisozima Insulina Citocromo c Quale tipo o tipi di cromatografia si possono utilizzare? In quali condizioni sperimentali si deve lavorare? Indicare le condizioni iniziali e quelle di eluizione Ipotizzare il grafico di eluizione corrispondente

4 SCAMBIATORE CATIONICO (CM-CELLULOSA) EQUILIBRATA CON TAMPONE A ph Emoglobina Ribonucleasi Lisozima Citocromo C Albumina Insulina Sono immobilizzati in colonna: li eluisco con un gradiente crescente di forza ionica [NaCl] o di ph (da ph 6.0 a ph 12.0) Non si legano alla CM-cellulosa, sono eluite insieme col volume morto Ass (276 nm) Albumina, Insulina Hb pi 7.1 Ribonucleasi pi 7.8 Citocromo C pi 10.6 Lisozima pi 11.0 Tm T1 T2 T3 T4 T. el. (min)

5 GEL-FILTRAZIONE ALBUMINA Da INSULINA 6500 Da SEPHADEX G50: BIO-GEL P-10: BIO-GEL P30: Ass (276 nm) Albumina Eluisce col volume vuoto Insulina È compresa nel range di frazionamento; è eluita con un volume di ritenzione che dipende dal suo coefficiente di ripartizione T0 (V0) Tr (Vr) T. el. (min)

6 TECNICHE ANALITICHE DI RIVELAZIONE PER PROTEINE TECNICHE SPETTROSCOPICHE: Rivelazione in base all interazione fra proteine e radiazione elettromagnetica. Determinazione della concentrazione (quantificazione) Studio della struttura TECNICHE ELETTROFORETICHE: Rivelazione in base alla migrazione differenziale delle proteine in un campo elettrico Valutare il grado di purezza Determinazione peso molecolare (approssimativo) e del pi Identificazione se accoppiate a spettrometria di massa e immuno-rivelazione Quantificazione SAGGI FUNZIONALI: per es. enzimatici, interazione con ligandi, attività antibatterica/antivirale.. SPETTROMETRIA DI MASSA: Identificazione della/e proteina/e mediante la misura della massa molecolare con elevata accuratezza e precisione, determinazione della sequenza e delle modificazioni post-traduzionali Quantificazione Elevata sensibilità TECNICHE IMMUNOLOGICHE: Identificazione mediante interazione con anticorpi specifici (es: western-blotting) Determinazione della concentrazione (ELISA) Elevata sensibilità

7 TECNICHE ELETTROFORETICHE Sono tecniche di separazione che sfruttano la migrazione di molecole provviste di carica elettrica sotto l influsso di un campo elettrico. Le proteine possono avere un numero variabile di gruppi ionizzabili (catene R di His, Arg, Lys, Asp, Glu, Ammino-term., Carbossi-term.) e quindi ad un dato ph possono avere carica + o -, dunque hanno la capacità di muoversi in un campo elettrico. Molecole di interesse biologico che possono essere separate mediante elettroforesi: Aminoacidi Proteine Nucleotidi Acidi nucleici Tali molecole possono essere separate in base alla loro diversa MOBILITA ELETTROFORETICA

8 Molecole cariche che si muovono in un campo elettrico sono soggette all influenza di due diverse forze: Forza del campo elettrico Forza frizionale F el = q E F fr = v f q= intensità di carica elettrica E= intensità del campo elettrico applicato Ione + circondato da controioni - v= velocità di migrazione f = coefficiente frizionale, attrito esercitato dal mezzo sul movimento dello ione, dipende da: Dimensione e Forma dello IONE, Porosità del supporto, viscosità del mezzo _ +

9 In un campo elettrico costante le 2 forze si bilanciano F el = F fr q E = v f v = q E / f la velocità di migrazione dipende dall intensità di carica e del campo elettrico e dal coefficiente frizionale v = q E / f v/e = q/f = v/e = q/f Il rapporto fra velocità di migrazione e intensità di campo elettrico è la mobilità elettroforetica = v (quando l intensità del campo elettrico è unitaria) f = dipende dalla massa della molecola, dalle sue dimensioni e dalla viscosità del mezzo, per la legge di Stokes f = 6 π η r v r = raggio della molecola (o di Stokes) η = viscosità del mezzo v = velocità elettroforetica = q 6 π η r v

10 Elettroforesi zonale: uso di supporti per la separazione carta da filtro acetato di cellulosa risultati accettabili x molecole di piccole dimensioni, effetto frizionale minimo, la separazione si basa solo sulla carica gel di poliacrilamide gel di agarosio notevole aumento di risoluzione per effetto setaccio del gel, effetto frizionale molto forte

11 TECNICHE ELETTROFORETICHE SU GEL DI POLIACRILAMIDE (PAGE) 1) In condizioni native (PAGE nativa) 2) In condizioni denaturanti in presenza del detergente ionico SDS (SDS-PAGE), separa le proteine unicamente in base al PM 3) In gradiente di ph (Isoelettrofocalizzazione: IEF) separa le proteine unicamente in base al pi 4) Elettroforesi Bidimensionale (2D-PAGE) separa le proteine in base al pi e al PM

12 PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (PAGE): utilizza un supporto di poliacrilamide La formazione di poliacrilmide è una reazione radicalica che richiede: 1) 2- Iniziatore: Ioni Persolfato, o Ammonio Persolfato (AP) >> S 2 O 8 2) Catalizzatore: N,N,N,N tetrametil-etilendiamina (TEMED) >> (CH 3 ) 2 -N-CH 2 -CH 2 -N(CH 3 ) 2 3) Monomeri di acrilamide (per formare le catene) 4) Monomeri di Bisacrilamide (per formare i ponti fra le catene) TEMED Radicale solforico TEMED Acrilamide Metilen-bisacrilamide Ioni persolfato Radicali solfato: INIZIATORI della reaz. Radicalica TEMED Polimerizzazione

13 I gel di poliacrilamide possono essere facilmente preparati in laboratorio scegliendo opportunamente le dimensioni con cui si formerà la maglia, il reticolo polimerico, queste sono definite dal valore di T (può variare tra 3 e 18%): DENSITA del gel, ossia la concentrazione totale di acrilamide espressa in %. acrilamide (g) + bis acrilamide (g) %T= x 100 volume (ml) T grande= maglie strette rallenta molecole in base alle loro dimensioni %T INTERVALLO DI FRAZIONAMENTO T piccolo= maglie larghe rallenta solo le molecole più grandi Un altro parametro usato per valutare la porosità del gel è la concentrazione percentuale (C%) del crosslinkante (bisacrilammide). bis acrilam (g) %C = x 100 acrilamide (g) + bis acrilam(g)

14 La polimerizzazione radicalica è molto veloce e la miscela acrilammide/bisacrilammide in presenza dei catalizzatori passa dallo stato liquido allo stato solido di gel. Acrilammide e bisacrilammide SONO TOSSICI quando sono nello stato di polvere o liquidi, perciò vanno maneggiati con ogni precauzione e con opportuni di dispositivi di protezione. Non sono più tossici nello stato di gel. La soluzione di acrilammide/bisacrilammide ancora liquida viene fatta polimerizzare sotto forma di strato sottile: nello spazio compreso fra due lastrine di vetro (0,75-1 mm), in modo da creare una setaccio molecolare uniforme nell intera superficie del gel. Riempimento dello spessore fra le lastrine con la soluzione di Acril./Bisacril.

15 Formazione dei pozzetti: inserimento di un «PETTINE» nella parte superiore della soluzione: verrà rimosso dopo che il gel ha polimerizzato Le lastrine con il gel polimerizzato vanno montate in un supporto opportuno (CAMERETTA ELETTROFORETICA) che permette di mettere a contatto la parte superiore e quella inferiore del gel con una soluzione tampone. Il tampone permette il contatto elettrico fra gel e elettrodi, e quindi garantisce la continuità del campo elettrico lungo tutto il gel Lastrine di vetro

16 CAMERETTA ELETTROFORETICA Utilizzando le lastrine col gel e una lastra di plastica viene assemblata una cameretta elettroforetica. Tampone dentro la cameretta interna La cameretta è alloggiata all interno di una camera più ampia. Viene versato il «tampone di corsa» nella cameretta interna e in quella esterna Le estremità del gel, e gli elettrodi sono immersi nel tampone. Tampone nella camera esterna

17 Sui pozzetti si possono caricare diversi campioni: proteine purificate, Miscele proteiche più o meno complesse Proteine incognite e proteine standard Il caricamento dei campioni va fatto in assenza di campo elettrico. Dopodiché la cameretta viene chiusa e si applica la corrente. Campioni Catodo CATODO negativo Direzione di migrazione Catodo ANODO positivo

18 Si applica il voltaggio collegando gli elettrodi ad un alimentatore Le proteine presenti nei campioni caricati nei pozzetti iniziano a muoversi attraverso il gel, nella direzione del campo elettrico. Proteine presenti in miscela sono separate per effetto della loro dimensione dal gel che funziona da setaccio molecolare. LE PROTEINE SI MUOVONO CON DIFFERENTE MOBILITÀ ELETTROFORETICA TEMPO DELLA CORSA ELETTROFORETICA SONO SEPARATE. E DURANTE IL

19 Preparazione campioni proteici: in soluzione tampone (a ph opportuno) + glicerolo (per aumentarne la densità) + tracciante (blue di bromofenolo) DEVE ESSERE UNA MOLECOLA CON: carica ( ) colorata basso PESO MOLECOLARE DEVE MUOVERSI NEL CAMPO ELLETTRICO (VERSO L ANODO), ATTRAVERSO LE MAGLIE DEL GEL, PIU VELOCEMENTE DI TUTTE LE PROTEINE PRESENTI NEI CAMPIONI CARICATI NEI POZZETTI Il tracciante consente di seguire la corsa elettroforetica dal momento che non è possibile visualizzare le proteine presenti nei campioni. La corsa è interrotta quando il tracciante arriva alla fine del gel: siamo sicuri che le proteine, che hanno una mobilità elettroforetica INFERIORE rispetto al tracciante non sono fuoriuscite dal gel.

20 FISSAZIONE E COLORAZIONE DEL GEL. Da effettuare al termine della corsa elettroforetica. Bisogna che le proteine siano immobilizzate nella posizione raggiunta durante la separazione elettroforetica e colorate in modo specifico. Si può utilizzare una soluzione che funziona da fissante e colorante insieme: per es., Coomassie Brilliant Blue in soluzione alcolica/acida Si immerge il gel nella soluzione fissante/colorante. Dopo un certo tempo si procede alla DECOLORAZIONE: il colorante è rimosso dal gel con una serie di lavaggi in soluzione acida/alcolica. Il colorante legato in modo aspecifico al gel è lavato via, rimangono colorate solo le proteine con cui il colorante ha interagito in modo specifico.

21 CONSERVAZIONE DEL GEL Il gel sviluppato può essere conservato a lungo termine se essiccato fra due fogli di cellophane: All aria In incubatore a temperatura superiore a quella ambiente

22 Direzione di migrazione PAGE NATIVA Per preparare un gel di poliacrilamide (x PAGE nativa) occorre: Soluzione acquosa contenente i monomeri di acrilamide e bisacrilamide Catalizzatori (AP e TEMED) Soluzione tampone a ph basico (per caricare negativamente le proteine) Le proteine con carica negativa si muoveranno verso l anodo, con mobilità elettroforetica diversa a seconda della loro intensità di carica e del coefficiente frizionale = q/f Il gel funziona da SETACCIO MOLECOLARE. Molecole più piccole, in movimento in un campo elettrico, con un coefficiente frizionale più basso e un intensità di carica più elevate hanno una mobilità elettroforetica più elevata. Molecole più grandi avranno una mobilità elettroforetica più bassa, sono rallentate.

23 SDS-PAGE = Elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di sodio dodecil solfato (SDS) CONDIZIONI DENATURANTI Il detergente ionico SDS interagisce con le proteine con un rapporto costante: 1 molecola di SDS ogni 2 residui amminoacidici (1,4 g SDS/g proteina) proteina

24 Preparazione campioni proteici. Le proteine devono essere solubilizzate in: + soluzione tampone (a ph opportuno) + glicerolo (per aumentare la densità) + blue di bromofenolo (tracciante) + SDS (detergente ionico denaturante) + 2-mercaptoetanolo (x rompere i ponti S-S) HS-CH 2 -CH 2 -OH Incubazione a 100 C x 5 minuti (denaturazione al calore, ma la proteina non precipita per la presenza del detergente che ne aumenta la solubilità!) AGENTI DENATURANTI

25 La carica nativa della proteina viene mascherata: tutti i complessi SDSproteine sono carichi negativamente e il rapporto carica/massa (z/m) è simile per tutte le proteine. = q/ f q = z/m ( rapporto carica/massa) La mobilità elettroforetica dipende dal coefficiente frizionale, cioè dalla viscosità del supporto (che è la stessa per tutte le proteine caricate sullo stesso gel, in SDS-PAGE) e dal raggio si stokes delle proteine, cioè dalle loro DIMENSIONI MOLECOLARI (che possono essere diverse) e quindi dall azione di setaccio molecolare del gel. Applicazioni dell SDS-PAGE Analisi di miscele proteiche Valutazione purezza di una proteina Determinazione PM

26 Con l SDS-PAGE è possibile avere indicazioni sul peso molecolare delle proteine che sono separate elettroforeticamente, raffrontando la loro mobilità elettroforetica con quella di proteine a PM noto. Importante: le proteine a PM noto scelte vanno abbinate al T del gel e viceversa. Infatti migrano differentemente a seconda del T. es: kda kda PROTEINE A PM NOTO T=

27 DETERMINAZIONE DEL PESO MOLECOLARE Si sceglie la %T a cui preparare il gel Su un pozzetto si caricano proteine standard, a PM noto (bisogna scegliere proteine che rientrino nel range di frazionamento del gel) Su gli altri pozzetti si caricano le proteine a PM incognito A fine corsa si rivelano le bande e si misura la distanza percorsa dalle proteine standard rispetto al punto di partenza Si misura la distanza percorsa dalla proteine incognita SI COSTRUISCE UNA RETTA STANDARD

28 SDS-PAGE = separazione elettroforetica di proteine in condizioni denaturanti È persa la Struttura TERZIARIA e quella QUATERNARIA delle proteine Se una proteina nella sua conformazione nativa è costituita da 2 o più subunità diverse, in SDS-PAGE si ottiene la separazione delle subunità. Hb, pe es.: si separano le subunità beta da quelle alfa = 2 BANDE a PM diversi Proteina a PM incognito

29 PAGE DISCONTINUA Usata per migliorare il potere risolutivo dell elettroforesi: il gel finale è costituito da due gel con un %T differente: -GEL INFERIORE (RUNNING GEL o GEL DI SEPARAZIONE) -GEL SUPERIORE (STACKING GEL o GEL DI IMPACCAMENTO) Gel inferiore T (7-18%) Tris-HCl ph 8.8 Gel superiore T= 3-5% Tris-HCl ph 6.8 Ha un T più basso rispetto al running gel e possiede un ph più acido. NON HA NESSUN EFFETTO DI SETACCIO MOLECOLARE Viene preparato con un T maggiore rispetto al gel superiore e in una soluzione tampone a ph più alto. Dopo la sua polimerizzazione vi si versa sopra il gel superiore. I pozzetti sono formati nel gel superiore.

30 La funzione del gel superiore è quella di concentrare le proteine caricate nei diversi pozzetti in bande molto strette che si focalizzano tutte alla stessa altezza sulla parte superiore del running gel. Tampone della cella: Tris-glicina + SDS ph 8.3 Lo stacking gel ha ph 6.8: la glicina è quasi neutra (6.8 < pka2) e la glicina migra più lentamente rispetto agli ioni Cl - presenti nel gel. A questo ph la glicina (pi =5.9) è carica negativamente e sotto l effetto del campo elettrico entra nello stacking gel. Tris-glicina Tris-HCl Tris-HCl Nel running gel il ph è 8.8: glicina è di nuovo carica negativamente e migra insieme agli ioni Cl- verso l elettrodo positivo. Le proteine complessate dall SDS si trovano comprese tra gli ioni Cl - e la glicina, come schiacciate da questi due fronti ionici, e migrano tutte alla stessa elevata velocità: tutte raggiungono rapidamente il letto del gel inferiore e si focalizzano come delle strette bande.

31 T= 4% Tris-HCl ph 6.8 T = 7-18% Tris-HCl ph 8.8 I complessi SDS-proteine si muovono molto velocemente e formano una banda molto stretta = si concentrano. Tutte le protein entrano nel gel di separazione nello stesso momento, per tutte la separazione inizia dallo stesso starting point.