Amplificazione mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) del DNA estratto dalla saliva.

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1 OBIETTIVO DEL LAVORO SPERIMENTALE: TIPIZZAZIONE DEI CROMOSOMI SESSUALI X e Y Amplificazione mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) del DNA estratto dalla saliva. Cromosoma X Cromosoma y

2 La tipizzazione dei cromosomi sessuali X ed Y tramite PCR, spesso utilizzata in medicina forense, può essere condotta attraverso: 1) Amplificazione di una porzione genica presente nel primo introne del gene codificante per l Amelogenina (AMEL) 2) Ricerca del DNA α-satellite presente a livello dei centromeri dei cromosomi X e Y

3 Amelogenina Amplificazione di una porzione genica presente nel primo introne del gene codificante per la proteina Amelogenina (AMEL) proteina coinvolta nel processo di produzione dello smalto dei denti, rappresentando in questa sede il 90% circa di tutta la componente proteica dello smalto. Xp22 (AMELX) Il locus genico Yp11 (AMELY) alcune differenze nella sequenza

4 Delezione di 6 bp in corrispondenza di una regione del primo introne del gene AMELX rispetto al gene AMELY PCR esone introne esone introne esone gli individui di sesso femminile essendo omozigoti per la delezione sul primo introne del gene AMELX, presenteranno un solo prodotto di amplificazione di 106 bp gli individui di sesso maschile essendo eterozigoti per la delezione sul primo introne, presenteranno due prodotti di amplificazione, uno di 106 bp relativo al gene AMELX, e uno di 112 bp, relativo al gene AMELY.

5 Amplificazione di una porzione genica presente nel primo introne del gene AMEL DNA estratto da filtro di sigaretta X M λϕx174 XY I prodotti di amplificazione essendo molto vicini come numero di paia di basi, vengono preferenzialmente separati mediante metodi automatizzati (es. elettroforesi capillare), piuttosto che con convenzionali 106 bp 112 bp metodi elettroforetici su gel di poliacrilamide o agarosio. 106 bp

6 La tipizzazione dei cromosomi sessuali X ed Y tramite PCR, spesso utilizzata in medicina forense, può essere condotta attraverso: 1) Amplificazione di una porzione genica presente nel primo introne del gene codificante per l Amelogenina (AMEL) 2) Ricerca del DNA α-satellite presente a livello dei centromeri dei cromosomi X e Y UTILIZZEREMO QUESTO SECONDO METODO DI INDAGINE

7 Ricerca del DNA α-satellite presente a livello dei centromeri dei cromosomi X e Y Il DNA α-satellite o alfoide è una sequenza monomerica con una tipica composizione di basi (A+T) ripetuta in tandem a formare dei blocchi che rappresentano fino a 3-5% del DNA totale di ciascun cromosoma kb nel cromosoma Y kb nel cromosoma kb nel cromosoma X

8 Ottenere, (utilizzando la tecnica della PCR in presenza di coppie di primers specifici in grado di intercettare le sequenze alfoidi dei cromosomi X ed Y), prodotti di amplificazione relativi a ciascun cromosoma sessuale, rilevabili mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide. OBIETTIVO DEL NOSTRO LAVORO

9 PCR (Polymerase Chain Reaction) Simultanea amplificazione del DNA alfoide centromerico presente nel cromosoma X e regione in quello Y.

10 PCR (Polymerase Chain Reaction) La simultanea amplificazione del DNA alfoide centromerico, sarà condotta utilizzando due coppie di primers in grado di delimitare una regione di ~150 bp presente nel cromosoma X e una regione di 200 bp in quello Y. X3 5' TATTTGGACTCTCTCTGAGGA X4 5' - TTCTACTACAAGGGTGTTGCA Cromosoma X Y3 5' - GTGTATRCACCTCCGGGAG Y4 5' - ACAAAAGGTTCAATTCTGTGAG Cromosoma Y

11 Amplificazione del DNA alfoide (Kit sigma JumpStart Taq DNA Polymerase) MISCELA DI REAZIONE volume finale di 25 µl: - 5,45 µl di H 2 O sterile - 12 µl di DNA (1 ng) - 2,5 µl Buffer 10x (10mM Tris-HCl ph 8,5) - 0,7 µl Formamide - 1,5 µl MgCl 2 25 mm - 0,5 µl dntp mix (datp, dctp, dgtp, dttp) - X3 for 0,5 µl - X4 rev0,5 µl - Y3 for 0,5 µl - Y4 rev 0,5 µl primers - 0,35 µl di Taq Polimerasi (1U )

12 FILE DI AMPLIFICAZIONE 6 95 C // 1 95 C C C // C 45 cicli

13 ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMIDE I prodotti di amplificazione saranno separati tramite elettroforesi su gel di poliacrilamide e visualizzati mediante colorazione con nitrato d argento.

14 RISULTATI Amplificazione del DNA alfoide RISULTATI ATTESI prodotto di amplificazione di 150 bp relativo al cromosoma X prodotto di amplificazione 200 bp relativo al cromosoma Y 200 bp 150 bp

15 ESERCITAZIONE DEL 22 MAGGIO GRUPPI DI LAVORO Elettroforesi su gel di poliacrilammide (1 gel per ogni gruppo) Colorazione del gel con il nitrato d argento PREPARARE LE SOLUZIONI (ciascun gruppo preparerà le proprie soluzioni)

16 SOLUZIONI PER IL GEL DI POLIACRILAMIDE Sol Acrilamide Bis - acrilamide 40% Ammonio Persolfato 10% (APS) TEMED = si usa concentrato PREPARAZIONE DEL GEL H 2 O = 17 ml TBE 10 x = 4 ml Sol. Acrilamide / bis-acrilamide =9 ml APS = 300 µl TEMED = 30 µl PREPARAZIONE DEI CAMPIONI 10 µl prodotto di PCR 2 µl loading buffer MARCATORE DEI FRAMMENTI DI GRANDEZZA DEL DNA (uno per ogni gel) 3 µl prodotto di marcatore 2 µl loading buffer

17 PREPARAZIONE DEI VETRI Pulire accuratamente i vetri con etanolo 70% Assemblare i vetri CONDIZIONI ELETTROFORETICHE = 200 Volt costanti TAMPONE DI CORSA = Buffer TBE 1x DURATA DELLA CORSA = fermare la corsa quando il blu di bromofenolo raggiunge il bordo del gel

18 COLORAZIONE CON NITRATO D ARGENTO PREPARAZIONE DELLE SOLUZIONI (usare acqua distillata) Indossare 2 paia di guanti e mettere gli occhiali protettivi 500 ml di Etanolo 10% 500 ml HNO 3 1% (attenzione: preparare sotto cappa) 500 ml AgNO 3 12 mm 500 ml soluzione di Na 2 CO 3 anidro 0,28 M + formalina tale da avere una concentrazione finale pari allo 0,019% 500 ml Acido acetico 10% (attenzione: preparare sotto cappa) 500 ml di Glicerolo al 5%

19 Etanolo 10% =agitare per 5 min. HNO 3 1% = agitare per 2 min. H 2 O distillata = agitare per 1 min. AgNO 3 12 mm = agitare per 20 min. H 2 O distillata = agitare per 3 min. COLORAZIONE Na 2 CO 3 anidro 0,28 M + 0,019% formalina = lasciare in agitazione sino alla comparsa delle bande. Acido acetico 10% = agitare per 3 min. Glicerolo 5% = agitare per 3 min. Al termine della colorazione trasferire il gel su un foglio di carta" Whatman" 3MM e ricoprirlo con un foglio di cellophane Il gel è ora pronto per essere essicato

20 COLORAZIONE DEL GEL CON NITRATO DI ARGENTO Un modo più sensibile ma anche più laborioso e dispendioso di visualizzare bande di DNA in gel di poliacrilamide, comporta la colorazione del DNA con argento. Questo metodo si basa sulla chimica usata nello sviluppo fotografico. Il gel è immerso in una soluzione diluita di etanolo per fissare il DNA al gel. Quindi il gel viene incubato con una soluzione acida di nitrato di argento, che reagisce con i nucleotidi delle singole eliche di DNA: si forma un precipitato in corrispondenza del DNA in seguito alla riduzione dell'argento ionico alla forma metallica, per opera della formaldeide a ph alcalino (sodio carbonato). Lo sviluppo viene fermato acidificando la soluzione con acido acetico. In media il metodo è da 10 a 100 volte più sensibile della colorazione con bromuro d'etidio