Esercitazione di Antropologia Molecolare

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1 1 2 AMPLIFICAZION L NA MIANT RAZION I PCR Progetto Lauree Scientifiche (Polymerase Chain Reaction) sercitazione di Antropologia Molecolare Cromosoma Y 1. Introduzione 1.1 Che cosa studia l Antropologia Molecolare L Antropologia Molecolare, una disciplina relativamente recente nell ambito di quelle dedicate allo studio dell Uomo, è incentrata sull analisi della variabilità biologica delle sue popolazioni. Lo studio di questa variabilità, non necessariamente corrispondente a quella osservabile da un punto di vista culturale e/o linguistico, permette di ricostruire l origine e l eventuale mescolamento delle popolazioni umane, nonchè la storia evolutiva dell intera specie (Homo sapiens), dalla sua nascita in Africa, all incirca anni fa, alle migrazioni che hanno portato al popolamento dei restanti continenti. NA mitocondriale 1.2 I marcatori classici Prima dell avvento della PCR lo studio di questa variabilità era condotto mediante l analisi dei cosiddetti marcatori classici, le proteine. In particolare si studiavano le proteine presenti sulla membrana dei globuli rossi e quelle liberamente circolanti nel sangue. Le più conosciute sono quelle che determinano i sistemi gruppo ematici (i gruppi sanguigni, ad esempio AB0, Rh); gli isoenzimi eritrocitari (forme molecolari diverse di uno stesso enzima, come ACP, PGM, 6-PG) e le proteine sieriche (aptoglobine e transferrine circolanti nel sangue). 1.3 I marcatori genetici Nel 1983 il biochimico e premio Nobel Kary Mullis mise a punto per la prima volta la reazione di PCR (Polymerase Chain Reaction), cioè l amplificazione di specifici segmenti di NA fino all ottenimento dell elevatissima quantità di copie necessaria per una sua successiva analisi. Questa innovazione ha permesso di passare dallo studio delle proteine direttamente a quello dei geni, i segmenti di NA responsabili della loro produzione.

2 3 4 La variabilità delle popolazioni umane osservata a livello proteico è, infatti, il risultato di una ben maggiore variabilità genetica, che consiste in differenze, da individuo a individuo, nella sequenza nucleotidica dei geni che portano a differenze nella sequenza amminoacidica delle relative proteine. Un polimorfismo genetico è quindi una determinata posizione nella sequenza del NA che risulta variabile fra gli individui di una stessa specie ed è tale quando una sua variante presenta una frequenza di almeno 1% in una data popolazione. Polimorfismi unici (M91, M31, YAP ) Aplogruppi (A, B, C ) 1.4 I marcatori genetici uniparentali I principali marcatori genetici studiati nell ambito dell Antropologia Molecolare sono i polimorfismi presenti sul cromosoma Y e sul NA mitocondriale. Rispetto ai cromosomi autosomici (la stragrande maggioranza del NA contenuto nel nucleo delle cellule), questo materiale genetico ha una trasmissione uniparentale, esclusivamente da padre a figlio (il cromosoma Y) e da madre a figlio/a (il NA mitocondriale), senza cioè che avvenga ricombinazione, ovvero il rimescolamento di parti del NA materno e paterno nei figli. quindi possibile determinare la discendenza e l ancestralità degli individui nella linea materna e in quella paterna, poiché individui con un origine comune condivideranno gli stessi polimorfismi. 1.5 Il cromosoma Y Il cromosoma Y è uno dei due cromosomi sessuali della nostra specie, in particolare quello che determina il sesso maschile e si trova quindi solamente nei maschi. Poiché il 95% della sua sequenza è non ricombinante, nel corso della nostra storia evolutiva è stato trasmesso pressoché inalterato nel corso delle generazioni dai progenitori ancestrali maschi. Pertanto le attuali differenze fra individui sono dovute esclusivamente all accumulo di mutazioni nel tempo. Questo permette di individuare polimorfismi che avendo un basso tasso di mutazione, non essendo quindi ricorrenti ma unici, risultano spesso specifici di determinate popolazioni o aree geografiche e vengono pertanto utilizzati per costruire la filogenesi del cromosoma Y rappresentata sotto forma di albero. Percorrendo i rami evolutivi di questo albero, alla cui radice si trova l ipotetico antenato comune, si arriva fino alle diramazioni recenti, che testimoniano le ultime mutazioni avvenute. Inoltre, seguendo un ordine gerarchico i cromosomi Y analizzati possono essere raggruppati in linee dette aplogruppi, definiti dalla presenza di determinati polimorfismi. Albero filogenetico del cromosoma Y

3 Il polimorfismo YAP Lo YAP appartiene alla famiglia dei polimorfismi Alu ed è costituito da un inserzione di 280 paia basi nel sito nucleotidico YS287, situato sul braccio lungo del cromosoma Y. Le due forme (alleli), YAP- (assenza di inserzione) e YAP+ (presenza di inserzione), indicano rispettivamente la forma ancestrale e quella derivata, che sembra essere comparsa, circa , anni fa, anche se non è ancora chiaro se si sia originata in popolazioni del continente africano o asiatico. Gli individui che presentano l inserzione YAP sul proprio cromosoma Y possono appartenere a due soli aplogruppi: o. Per questo motivo tale polimorfismo viene generalmente testato sull intero campione come screening iniziale per indirizzare le analisi successive in quanto permettere di distinguere due grossi gruppi di linee del cromosoma Y ( e / tutti gli altri aplogruppi). O B A K Q F G C L P filamenti che ne costituiscono la doppia elica. La Taq polimerasi viene infatti estratta dal betterio termofilo Thermus acquaticus, che vive in natura a temperature prossime agli 80 C. L utilizzo di questo enzima permette quindi di riprodurre in vitro quanto avviene all interno delle cellule quando il NA viene copiato, garantendo la selezione, l isolamento e l amplificazione di qualsiasi regione del NA di cui si conoscano le estremità fiancheggianti a monte e a valle. Perché la polimerasi possa svolgere la sua funzione è tuttavia necessario fornirgli i reagenti che essa utilizzerebbe all interno delle cellule: dntps = deossinucleotidi trofosfati (datp, dttp, dctp, dgtp). Sono costituiti da una base azotata (adenina, timina, citosina, guanina) legata ad un deossiribosio, uno zucchero privo del gruppo OH in posizione 2 e con 3 gruppi fosfato in posizione 5. Nella miscela di reazione i 4 deossinucleotidi devono essere presenti in eguale quantità in modo che la polimerasi abbia la stessa probabilità di utilizzarli, a seconda di quello necessario ad ogni inserzione. La polimerasi aggiunge un deossinucleotide alla volta, legandone il gruppo fosfato in posizione 5, al gruppo OH in posizione 3 dell ultimo nucleotide del primer. In tal modo ogni nucleotide viene appaiato al nucleotide complementare presente sul filamento di NA stampo, grazie ai legami idrogeni che si formano fra le rispettive basi azotate. R H I J M N YAP+ YAP- Cromosomi Y appartenenti agli aplogruppi, (YAP+) e ai restanti aplogruppi (YAP-) 3. La reazione di PCR (Polymerase Chain Reaction) La PCR è una reazione che sfrutta la capacità di una polimerasi batterica, l enzima che nelle cellule batteriche si occupa di copiare il NA quando il batterio si moltiplica, di resistere a temperature sufficientemente alte da permettere la denaturazione del NA, ovvero la separazione dei due MgCl 2 = cloruro di magnesio. Fornisce gli ioni Mg ++ che fungono da catalizzatori necessari per il funzionamento della polimerasi. Buffer = tampone di reazione. Soluzione salina che garantisce le condizioni chimico-fisiche idonee per un ottimale attività della polimerasi.

4 7 8 Primers = oligonucleotidi. Piccole sequenze di NA, lunghe basi, complementari alle sequenze fiancheggianti la regione che si vuole amplificare e alle quali si appaiano. al loro ultimo nucleotide la polimerasi inizia ad aggiungere i nucleotidi che costituiranno il nuovo filamento. Una volta miscelati i reagenti in una mix di reazione e aggiunto il NA che si vuole amplificare, la reazione di PCR avviene automaticamente all interno di un termociclatore, un apparecchiatura che compie gli innalzamenti ed abbassamenti di temperatura necessari allo svolgimento della reazione. Il ripetersi ciclico delle 3 fasi della reazione, generalmente per un numero totale di cicli, con il raddoppio del numero di frammenti di NA ad ogni ciclo, poiché entrambi i filamenti di ogni doppia elica di NA sono utilizzati come stampo, garantisce un incremento esponenziale delle copie di NA, fino ad alcuni milioni. Ogni ciclo di reazione è costituito da tre fasi: stensione = la temperatura è fatta risalire fino a raggiungere i 72 C, temperatura che garantisce la massima efficienza della Taq polimerasi. Si realizza così la rapida sintesi di un nuovo filamento di NA per ciascun filamento stampo, con l aggiunta di nucleotidi al secondo. La polimerasi procede nella sintesi in direzione 5-3, attaccando il gruppo fosfato in posizione 5 del nuovo dntp al gruppo OH in posizione 3 dell ultimo nucleotide del primer o, successivamente, dell ultimo nucleotide del filamento in costruzione. enaturazione = la temperatura è portata rapidamente a 94 C con conseguente rottura dei legami idrogeno fra le basi complementari dei due filamenti che compongono la doppia elica del NA e loro separazione. Allineamento dei primers = la temperatura viene diminuita rapidamente fino alla temperatura di melting (T M ), specifica di ogni tipo di primer, e alla quale i primers stessi si allineano alle regioni complementari presenti sui due filamenti di NA utilizzati come stampo. La formazione di legami idrogeno fra le basi azotate del primer e del filamento stampo ne garantiscono un appaiamento stabile. La polimerasi si lega a questo doppio filamento (NA stampo + primer) ed è così pronta ad iniziare la sua attività. Al termine dei cicli previsti, il cui numero varia in base alle dimensioni del frammento di NA che si vuole amplificare, avviene una fase di estensione finale, a 72 C per alcuni minuti, che assicura il completamento dell allungamento dei filamenti di NA rimasti incompleti. 3.1 Protocollo di amplificazione del marcatore YAP i seguito sono riportate le sequenze dei primers necessari per l amplificazione del frammento di NA di 150 paia basi contenente il locus YS287 sul quale può avvenire l inserzione YAP. YAP.F (forward) 5' CAG GGG AAG ATA AAG AAA TA 3' YAP.R (reverse) 5' ACT GCT AAA AGG GGA TGG AT 3'

5 9 10 L amplificazione di ciascun campione di NA è eseguita in un volume finale (V f ) di 25 µl di una miscela di reazione contenente i reagenti. i ciascuno di questi sono riportate in tabella la concentrazione iniziale di stoccaggio (C i ) e quella finale nella miscela di reazione (C f ). Per calcolare la quantità unitaria di ciascun reagente (V i ), necessaria per l amplificazione di un solo campione di NA, è necessario applicare la regola delle diluizioni di seguito riportata: Miscela di reazione Reagenti (C i ) regola delle diluizioni V i x C i = V f x C f CONC. Finale (C f ) H 2 O / NTPs Mix (10 mm) 0,4 mm QUANTITA' UNITARIA (µl) QUANTITA' x n tot campioni (µl) PRIMR F (10 µm) 0,2 µm K- PRIMR R (10 µm) 0,2 µm TOT MgCl2 (25mM) 2,5 mm BUFFR (5X) 1 X Taq (5 U/µl) 1 U Tot mix 24 NA (20 ng/µl) 1 Volume finale (V f ) 25 CICLI I PCR URATA TMP ( C) STP ATTIVAZION Taq 2 min 94 1 POPOLAZION: LISTA CAMPIONI NATURAZION 1 min 94 2 ANNALING 1 min cicli STNSION 90 sec 72 4 STNSION FINAL 5 min 72 5 STOP Visualizzazione dei risultati 4.1 lettroforesi su gel d agarosio Il successo della reazione di amplificazione e la presenza/assenza dell inserzione YAP vengono verificate mediante corsa elettroforetica dei frammenti di NA ottenuti su gel d agarosio. L elettroforesi su gel permette la separazione di frammenti di NA di dimensioni e peso differenti grazie all applicazione di un campo elettrico. Il NA, posto in una soluzione tampone con ph e salinità adeguate, mantiene una carica netta negativa, per la presenza dei numerosi gruppi fosfato che legano i nucleotidi all interno di ciascun filamento, e pertanto migrerà nel campo elettrico in direzione del polo positivo. urante questa migrazione i frammenti di maggiori dimensioni si muoveranno con maggior difficoltà e lentezza attraverso i pori del gel rispetto ai frammenti più piccoli e leggeri, rimanendo quindi più vicini ai pozzetti nei quali sono stati caricati. 4.2 Preparazione di un gel d agarosio al 2% 1. Pesare 0.6 g di agarosio in polvere e trasferirlo in una beuta facendo attenzione a non lasciarne sulle pareti. 2. Aggiungere 30 ml di TB 1X (tris-buffer-ta), chiudere la beuta con un po di carta d alluminio. 3. Trasferire la beuta sul becco bunsen (o nel forno a microonde ma rimuovendo la carta d alluminio) in modo da sciogliere l agarosio e mandarlo in soluzione. 4. Attendere qualche minuto che si raffreddi, aggiungere 1.5 µl di Bromuro di tidio che funge da intercalante delle basi azotate del NA permettendone la visualizzazione ai raggi ultravioletti. 5. Versare la soluzione nel vassoio dopo aver aggiunto i pettini ad una delle due estremità e al centro. 6. Attendere che il gel sia solidificato, togliere i pettini e sistemare il gel nella vasca di corsa, quindi aggiungere il tampone (TB 1X) fino a coprire il gel con un sottile strato.

6 Caricamento degli amplificati Preparare su parafilm tante gocce da 1-2 µl di Loading Buffer 6X e a ciascuna aggiungere 8 µl di NA amplificato, miscelare bene e caricare nei pozzetti del gel. Il buffer di caricamento ha la funzione di rendere visibile il campione durante la fase di caricamento ed appesantirlo affinché si depositi sul fondo del pozzetto. La corsa elettroforetica viene effettuata a 95 volt per un tempo di almeno 15 minuti. Infine la visualizzazione delle bande di NA viene effettuata mediante l esposizione ai raggi ultravioletti di un transilluminatore. Marrccattoorre mool leccool larree 430 bp (YAP+) 150 bp (YAP-) 430 bp (YAP+) 150 bp (YAP-)