ELETTROFORESI SU GEL

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1 ELETTROFORESI SU GEL

2 ELETTROFORESI SU GEL Metodo per separare le molecole (DNA, RNA, proteine, etc.) sulla base di proprieta fisiche o chimiche quali: (1)dimensioni (2)forma (3)carica elettrica

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4 L'AGAROSIO è un polisaccaride purificato dall'agar-agar, una sostanza gelatinosa estratta solitamente dalle Rhodophyta. È un polimero lineare la cui unità fondamentale è l'agarobiosio - un disaccaride composto da (1,3)-β-D-galattopiranosio-(1,4)-3,6-anidro-α-L-galattopiranosio, uniti tra loro da legame glicosidico.

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10 Il TRANSILLUMINATORE è uno strumento che permette di visualizzare i risultati di un elettroforesi su gel di agarosio. Il DNA viene colorato con bromuro di etidio un colorante fluorescente; per poter visualizzare le bande che si sono formate bisogna metterle in evidenza sfruttando la fluorescenza emessa dal colorante. Questi coloranti fluorescenti per emettere la fluorescenza devono assorbire raggi UV (quindi con lunghezze d'onda basse (tipo nm) e riemettere nel campo del visibile ( nm).

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13 AMPLIFICAZIONE DNA

14 PCR Polymerase Chain Reaction

15 La PCR è una tecnica relativamente recente che ha rivoluzionato la Biologia molecolare. Ideata da Kary Mullis intorno ai primi anni 80, è stata perfezionata e automatizzata al punto da sostituire molte tecniche di clonaggio tradizionale. La PCR è una tecnica estremamente versatile per copiare il DNA. Consente, attraverso una reazione enzimatica condotta mediante polimerasi termostabile, di copiare milioni di volte un frammento di DNA. La PCR può essere usata per introdurre siti di restrizione o mutare particolari basi azotate della sequenza del DNA. La PCR, in generale, può essere utilizzata per diversi scopi: ricerca di base, in diagnostica molecolare e in ambito forense.

16 DNA polimerasi Enzima presente nel nucleo delle cellule eucariotiche che sintetizza nuovi filamenti di DNA a partire da filamenti preesistenti usati come stampo.

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18 Con la PCR è possibile replicare un frammento di DNA al di fuori della cellula, cioè in vitro purché se ne conosca la sequenza!

19 Di che cosa abbiamo bisogno per una reazione di PCR * DNAtemplato * primers (inneschi) * dntps (deossinucleotiditrifosfa ti) * DNApolimerasi * Buffer conmg 2+

20 DNA TEMPLATO Qualsiasi DNA che contenga la sequenza da amplificare genomico - cdna DNA Non è necessario isolare prima la sequenza di interesse (specificità data dai primers) Quantità necessaria < 1µg (anche una sola molecola!)

21 Primers Corti oligonucleotidi (18-30) che si appaiano al filamento stampo a monte e a valle della sequenza di DNA da amplificare Sono disegnati dall operatore Si appaiano ad un determinato valore di temperatura detta Tm che viene calcolata tenendo conto del numero di basi, in particolare G e C

22 dntp s Nucleotide = base + zucchero + fosfato datp dgtp dct P dtt P Mix dei 4 dntps devono essere bilanciati ( errato) blocco della reazione o appaiamento

23 DNA polimerasi Taq = polimerasi estratta da Thermus aquaticus, microrganismo che vive in sorgenti termali alla temperatura di 75 C Aggiunge i dntps a partire da un innesco Direzione di allungamento 5 3

24 Buffer + Mg 2+ Mg 2+ Buffer = soluzione tampone con sali necessari a creare la condizione ideale per il funzionamento della Taq polimerasi Mg 2+ = stabilizzano l appaiamento degli oligonucleotidi con le sequenze complementari interagendo con le cariche negative dei gruppi P ü se eccedenti creano inaccuratezza favorendo gli appaiamenti tra sequenze nucleotidiche non omologhe

25 dtt P datp dgtp P dct Mg 2+ PCR MIX Þ la reazione non avviene a temperatura ambiente!

26 A temperatura ambiente: Il DNA è chiuso in configurazione a doppia elica DENATURAZIONE (94-99 C) I primers non si appaiano ANNEALING (30-65 C) La Taq polimerasi non funziona ESTENSIONE (65-72 C)

27 TERMOCICLATORE

28 94-99 C C C

29 94 C 5 minuti (hot start) Programma tipo di PCR 94 C 30 secondi (DENATURAZIONE) 65 C 30 secondi (ANNEALING) 72 C 1 minuto (ESTENSIONE) 30 cicli 72 C 5 minuti (finire le estremità 3 ) Þ ad ogni ciclo il materiale amplificato raddoppia (crescita esponenziale) Þ numero di cicli < 50 (plateau della reazione ed introduzione di errori)

30 Verifica della reazione di PCR PCR MIX

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32 Applicazioni della PCR Ingegneria genetica Diagnostica molecolare Evoluzione molecolare Ambito forense Analisi di laboratorio Scienze ambientali

33 Applicazioni della PCR CLONAGGIO SEQUENZE GENICHE DIINTERESSE - studio della funzione di ungene - studio dell evoluzione genica

34 Applicazioni della PCR GENETICA E RICERCA Ricerca mutazioni Diagnosi prenatale malattie ereditarie Determinazione del sesso Determinazione dei portatori in famiglie a rischio e popolazioni Marcatura sonde Genetica delle popolazioni Infezioni batteriche e virali

35 Applicazioni della PCR DIAGNOSTICA MEDICA Presenza e tipizzazione patogeni Tipizzazione tumori e attivazione oncogeni Monitoraggio e progressione tumori Attecchimento trapianti Falcemie, Talassemie, Fenilchetonuria, Diabete, Fibrosi cistica, Emofilia, Alfa1- antitripsina, Mutazioni DNA mitocondriale, Distrofia muscolare, Sindrome Lesch- Nyhan, Morbo di Huntington, Leucemia mieloide, Alterazioni oncogeni, Mutazioni apolipoproteine Malattie infettive: HIV, CMV, HBV, HCV, HPV, HSV, E. Coli, Trypanosoma, Toxoplasma, etc.

36 Applicazioni della PCR GENETICAFORENSE

37 Applicazioni della PCR

38 Applicazioni della PCR ü Ricerca di OGM e tracciabilità degli alimenti ü Analisi dei microrganismi in campo alimentare ed ambientale

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