SINTESI 1 lezione di CLIL /biotecnologie a cura di Marinelli Alessia, VCsa BIOTECNOLOGIE E DNA RICOMBINANTE

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1 SINTESI 1 lezione di CLIL /biotecnologie a cura di Marinelli Alessia, VCsa BIOTECNOLOGIE E DNA RICOMBINANTE Per biotecnologie si intende qualunque tecnica o pratica che modifica/utilizza organismi viventi allo scopo di sviluppare processi o prodotti utili per l uomo. Non si sa precisamente quando si è cominciato ad usare il termine biotecnologie: pare che il termine sia stato coniato agli inizi del 900 da un ingegnere ungherese, anche se la pratica delle biotecnologie è iniziata molto tempo prima. Gli allevatori e gli agricoltori dell età della pietra oltre anni fa, addomesticando animali e piante, diedero inizio alla rivoluzione biotecnologica anni fa i nostri antenati erano in grado di convertire l uva in vino, il latte in yoghurt e formaggio e il frumento in pane lievitato sfruttando microorganismi come batteri, lieviti e funghi. Anche Cinesi (7000 anni fa) ed Egizi (4000 anni fa) utilizzarono queste metodiche. Dal 19 secolo i contadini selezionarono specie animali e vegetali facendo ricorso ad incroci selettivi e all impollinazione incrociata e fecero uso di microrganismi per controllare gli insetti che devastavano le coltivazioni. Nella seconda metà del 20 secolo si sfruttarono i microrganismi per produrre antibiotici e vitamine. Dal 1983 vengono prodotti vaccini utilizzando batteri o cellule superiori geneticamente modificate. Grazie all'ingegneria genetica è possibile infatti trasferire i geni delle proteine (antigeni) presenti sulla superficie degli agenti patogeni in batteri o cellule superiori, in modo che questi le producano. Le proteine prodotte possono così essere utilizzate come vaccini, stimolando il sistema immunitario del ricevente. Ad esempio, il vaccino contro il virus dell'epatite B viene prodotto seguendo questa procedura. La moderna biotecnologia, a differenza di quella antica che agiva sugli organismi selezionandoli in base ai cambiamenti che comparivano per caso, ricorre a tecniche più precise, che modificano solo le parti interessate del genoma. L uso delle biotecnologie trova applicazioni in vari ambiti: agroalimentare, industriale, farmacologico. Si può parlare dunque di: 1. Biotecnologia verde: applicazione agricole; 2. Biotecnologia bianca: applicazioni industriali; 3. Biotecnologia rossa : applicazioni mediche; 4. Biotecnologia blu: applicazioni marine e acquatiche. Lo schema sottostante evidenzia le discipline che contribuiscono alla biotecnologia molecolare e la vasta gamma di prodotti commerciali che ne derivano.

2 Le biotecnologie si avvalgono della tecnologia del DNA ricombinante, che consiste nell utilizzo in vitro di tecniche molecolari per isolare e manipolare frammenti di DNA. Il DNA ricombinante è una sequenza di DNA ottenuta dalla combinazione di materiale genetico di diversa origine, che può essere inserito in altre cellule per essere copiato più volte (amplificato) ed espresso. Le tecnologie del DNA ricombinante e del clonaggio molecolare si sono rivelate fondamentali per comprendere struttura e funzione dei geni. Clonare in biologia molecolare significa generare una copia intera di un intero organismo oppure una copia identica di un frammento di DNA come un gene. Nel primo caso si parla di clonazione, nel secondo di clonaggio molecolare. Nel 1973, con il primo esperimento di clonaggio di un segmento genico inserito nel batterio Escherichia coli, Stanley Cohen e Herbert Boye dimostrarono che è possibile produrre copie multiple di un determinato gene. I MATERIALI NECESSARI PER IL PROCESSO DI CLONAGGIO SONO: un frammento di DNA, che può essere ricavato anche da un mrna (in questo caso viene detto cdna); specifici enzimi di restrizione che servono a tagliare il DNA; particolari enzimi in grado di unire le estremità di nucleotidi (DNA-ligasi); i plasmidi, vettori in grado di inserirsi nelle cellule ospiti; cellule batteriche modificate in modo da rendere la loro membrana permeabile al plasmide. I PLASMIDI SONO: molecole circolari di DNA a doppia elica, capaci di replicazione indipendente, che contengono alcuni geni (da uno a decine); presenti naturalmente nelle cellule batteriche, alle quali conferiscono caratteristiche peculiari; utilizzati in natura dai batteri per favorire il trasferimento di informazioni da una cellula all altra; in grado di trasportare un frammento genetico da un organismo all altro (vettori) come nella trasduzione.

3 I VETTORI PLASMIDICI CONTENGONO: un origine di replicazione (ori), sequenza necessaria per avviare la duplicazione autonoma del plasmide all'interno della cellula ospite; un gene marcatore, sequenza necessaria per selezionare le cellule che hanno incorporato il plasmide da quelle che ne sono prive; nei casi più semplici tale sequenza può essere un gene per la resistenza ad un antibiotico come l'ampicillina; sito di clonazione multipla o polylinker: tale sequenza contiene siti unici di riconoscimento per endonucleasi di restrizione, in cui inserire il DNA esogeno. I plasmidi possono conferire caratteristiche diverse ai batteri. Per esempio: plasmidi degradativi: consentono ai batteri di metabolizzare determinate sostanze, anche tossiche, come alcuni residui del petrolio o pesticidi; plasmidi Col: codificano per le colicine, proteine in grado di uccidere altri batteri; plasmidi della virulenza: trasformano le cellule ospiti in patogene; plasmidi F: consentono ai batteri di scambiare tra loro materiale genetico; plasmidi R: conferiscono resistenza ad alcuni antibiotici. Se trattiamo un frammento di DNA e un plasmide con lo stesso enzima di restrizione, il frammento può integrarsi nel plasmide, dato che le loro estremità sono complementari. L enzima DNA-ligasi unisce e richiude le estremità di DNA ripristinando il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti in una catena di DNA.

4 Gli enzimi di restrizione sono particolari enzimi, identificati nei batteri, che riconoscono e tagliano le sequenze nucleotidiche in punti specifici. I batteri li utilizzano per difendersi dal DNA estraneo, tagliandolo in più punti. Gli enzimi di restrizione possono effettuare due tipi di tagli: netti (il taglio genera estremità piatte), come l enzima Hpa1e Pvull sfalsati (il taglio genera estremità sporgenti) come gli enzimi EcoR1 e Hind3, che tagliano in maniera asimmetrica il DNA, creando estremità appiccicose, coesive (sticky ends) CLONAGGIO DI UN DNA ESOGENO Una volta che il plasmide è stato modificato (plasmide ricombinato), viene inserito in un batterio. Quando quest ultimo viene inserito in un terreno di coltura, inizia a replicarsi per scissione binaria e il nuovo DNA viene amplificato e i nuovi geni possono esprimersi producendo proteine o enzimi che possono essere utili per noi (vedi produzione di farmaci come l insulina, la somatostatina ecc). Negli anni 80 il chimico statunitense Karin Mullis inventò la reazione a catena della polimerasi (PCR) per produrre (amplificare) milioni/miliardi di copie di una sequenza di DNA in poco tempo.

5 Per eseguire una PCR si deve preparare una miscela di reazione contenente Taq polimerasi, nucleotidi liberi, primers, buffer di reazione (soluzione salina a ph neutro), MgCl2; essa va inserita in una macchina (termociclatore), che la sottopone a più cicli a differenti temperature. Gli step sono i seguenti: 1) i filamenti di DNA a doppia elica vengono sottoposti a riscaldamento e si separano in filamenti singoli (denaturazione); 2) i primers, sintetizzati artificialmente, si legano all estremità di ciascun filamento (annealing); 3) la DNA polimerasi (Taq polimerasi) catalizza la produzione di nuovi filamenti complementari con l aggiunta di nucleotidi all estremità 3 (polimerizzazione); 4)In pochi minuti, un singolo ciclo può raddoppiare la quantità di DNA presente in soluzione e lo riporta allo stato di doppio filamento. La ripetizione del ciclo per molte volte produce una crescita esponenziale del numero di copie della sequenza di DNA; per questo il processo prende il nome di amplificazione della sequenza. In questo modo il DNA viene replicato solo nelle sequenze utili alla ricerca. APPLICAZIONI della PCR (DIAGNOSTICA MEDICINA LEGALE BIOTECNOLOGIE RICERCA) Identificazione di agenti patogeni nell uomo, negli animali o negli alimenti (batteri e virus); Identificazione di organismi geneticamente modificati (OGM); Analisi del DNA in medicina legale (es. test di paternità, uso dei profili genetici, analisi DNA di sangue o sperma ); Diagnosi pre-natale di malattie genetiche da DNA di cellule embrionali (es. anemia falciforme, distrofia di Duchenne, talassemia); Diagnosi di malattie tumorali (es. linfoma); Clonaggio e sequenziamento (es. di frammenti di DNA rinvenuti in mammut lanosi congelati vissuti anni fa o di DNA di geni virali isolati da cellule infettate). ELETTROFORESI Tecnica analitica che permette la separazione differenziata di molecole cariche elettricamente (amminoacidi, peptidi, proteine, acidi nucleici, ecc) quando, immerse in un gel di agarosio (acidi nucleici) o di poliacrilammide (proteine), vengono sottoposte a un campo elettrico. La tecnica dell elettroforesi può essere applicata al DNA tagliato da enzimi di restrizione per separarne i frammenti o applicata alle proteine (es. elettroforesi delle sieroproteine per diagnosi malattie). Per quanto concerne il DNA, la tecnica si basa sul fatto che, a ph neutro, il DNA è carico negativamente per la presenza dei gruppi fosfato e se sottoposto a d.d.p, tende a migrare verso il polo positivo.

6 Applicando un campo elettrico, il DNA (carico negativamente) migra verso il polo positivo e le molecole si separano in base al peso molecolare (P.M.) Si visualizza la disposizione dei frammenti di DNA a bande grazie ad un colorante che diventa fluorescente ai raggi UV (con il transilluminatore). Una volta separati i frammenti si stabilisce la loro lunghezza e sequenza nucleotidica. La disposizione a bande è utile per operare confronti tra DNA conosciuto e DNA incognito, valutando somiglianze e differenze (es. individuazione geni alterati nelle malattie genetiche, confronto di DNA di persone sospette con DNA ritrovato sul luogo di un delitto).

7 BIBLIOGRAFIA E SITOGRAFIA p.p.t 1 lezione in inglese del 22/1/2016 libro di testo in uso Dal carbonio agli OGM plus Ed. Zanichelli wikipedia (immagini)