LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI PCR

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1 LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI PCR

2 INTRODUZIONE Tecnica ideata da Mullis e collaboratori nel 1984 La possibilita' di disporre di quantità virtualmente illimitate di un determinato frammento di DNA, anche quando il materiale di partenza e' estremamente esiguo o danneggiato da processi di degradazione, ha fatto di questo procedimento una delle scoperte più importanti nel campo della Biologia Molecolare

3 LA REAZIONE La PCR e' un metodo che permette di amplificare selettivamente in vitro, mediante una reazione a catena, sequenze stabilite di DNA o RNA di dimensioni fino a circa duemila paia di nucleotidi (basi), caratterizzandosi, quindi, per elevata specificita' anche nei casi in cui siano presenti molecole estranee a quelle d'interesse.

4 La reazione a catena della polimerasi si basa sul principio naturale della replicazione del DNA

5 REPLICAZIONE Reazione di polimerizzazione Reagenti: datp, dctp, dgtp, dttp Necessaria la presenza di un DNA a singolo filamento fungente da stampo Reazione catalizzata dalla DNA polimerasi Reazione semiconservativa

6 DNA POLIMERASI Enzimi capaci di costruire una nuova catena nel verso 5-3 Individuati da Arthur Kornberg nel 1958 Non possono iniziare ma solo allungare un filamento polinucleotidico preesistente (innesco)

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8 DIREZIONE DELLA REPLICAZIONE I nuovi filamenti vengono sempre sintetizzati in direzione 3' => 5'. Il 5' trifosfato può essere aggiunto solo ad un 3'OH del desossiribosio.

9 PCR Permette di verificare la presenza di una determinata sequenza nucleotidica nel DNA genomico di un organismo, amplificando la sequenza selettivamente e con enorme efficienza Permette di simulare la replicazione generazionale di DNA per le sequenze geniche scelte

10 FASI DEL PROCESSO DI AMPLIFICAZIONE Il processo di amplificazione è ripetitivo Per ogni ciclo vi sono una serie di passaggi successivi

11 1 FASE: DENATURAZIONE TERMICA La temperatura del mezzo viene portata a un valore tale da provocare la separazione delle catene complementari del DNA contenente la sequenza bersaglio (T>90 C)

12 Denaturazione

13 2 FASE: IBRIDAZIONE o ANNEALING La temperatura viene opportunamente abbassata per far si che le molecole a singolo filamento formatesi nella prima fase, possano formare un complesso sufficientemente stabile con i primers

14 2 FASE: IBRIDAZIONE o ANNEALING Calcolo della Temperatura di annealing C-G = 4 C A-T = 2 C A) 5 -GCGTTAGGCCAGCGGG-3 Tm = 56 C B) 5 -CCATTTGAAATTTATA-3 Tm = 38 C C) 5 -AGGTCCCCATCAGCGC-3 Tm = 54 C

15 Annealing

16 3 FASE: ESTENSIONE Una DNA polimerasi catalizza l estensione del primer che deve necessariamente formare un tratto a doppio filamento col DNA, in direzione 5-3

17 Estensione Velocità di incorporamento ~ 20 nucleotidi /sec

18 II Cycle

19 III Cycle

20 IV Cycle

21 V Cycle

22 Graphic

23 DNA thermal cyclers T gradient

24 EFFICIENZA DELL AMPLIFICAZIONE L accumulo esponenziale dei prodotti di amplificazione non è un processo illimitato Dopo un certo numero di cicli di amplificazione si raggiunge un livello di plateau

25 Polymerase Chain Reaction Reazioni più comunemente usate nel laboratorio diagnostico PCR singola PCR nested PCR multiplex RT-PCR Q-PCR (real time PCR)

26 nested PCR Primer st Round PCR Primer 1.2 Primer nd Round PCR Primer 2.2 Amplification product

27 nested PCR Vantaggi elevata specificità e efficienza prodotto dell amplificazione facilmente evidenziato dopo elettroforesi su gel di agarosio Svantaggi elevato rischio di falsi positivi

28 PCR multiplex Identificazione di virus differenti in una sola reazione Duplex PCR per polyomavirus umani BK e JC

29 Trascrittasi inverse RT-PCR virus della mieloblastosi aviaria (AMV) virus della Leucemia Murina di Moloney (M-MLV) Tth DNA-polimerasi -attività di trascrittasi inversa - attività di DNA polimerasi Amplificazione RNA virale genomico mrna virali

30 vantaggi Tecniche molecolari Elevata sensibilità e specificità Ricerca di virus difficilmente o non coltivabili Identificazione e tipizzazione Quantificazione del carico virale Facile automazione Rapidità di esecuzione Rischio di contaminazioni falsi positivi limiti Rischio di cross-reazioni con acidi nucleici non specifici Rischio di falsi negativi per inibitori Alti costi