Analisi degli alimenti tramite PCR Real-Time. Introduzione ad una tecnologia all'avanguardia

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1 Analisi degli alimenti tramite PCR Real-Time Introduzione ad una tecnologia all'avanguardia

2 Obiettivi Questa presentazione tratterà i seguenti argomenti: Quali sono le applicazioni della PCR Real-time? Come funziona la PCR Real-time? Che strumenti vengono usati? Come si presentano i risultati di una Real-time? Come possono essere usati questi dati per calcolare la quantità di DNA?

3 Cos'è la PCR? Qualsiasi essere vivente (batteri, piante, animali, virus, muffe, alghe) contiene acidi nucleici (DNA/RNA). Anche alimenti e mangimi sono costituiti da esseri viventi. Gli acidi nucleici di un essere vivente possono essere estratti utilizzando un metodo appropriato. Pertanto, utilizzando il metodo appropriato, il DNA (o l'rna) contenuto in alimenti e mangimi può essere estratto e purificato dagli altri componenti.

4 Cos'è la PCR? La Reazione Catena della Polimerasi (Polymerase Chain Reaction "PCR") è un processo che permette di copiare (amplificare in gergo tecnico) specifici frammenti di DNA (templato in gergo tecnico). Grazie alla sua specificità, la reazione copia solo questi specifici frammenti di DNA, anche quando sono dispersi in una moltitudine di altro DNA. Queste copie sono chiamate ampliconi

5 Cos'è la PCR? PCR DNA target (Templato) Ampliconi DNA disperdente

6 Cos'è la PCR? Gli ampliconi possono essere marcati con degli specifici reattivi chimici che emettono fluorescenza in presenza di DNA. La PCR quindi consente la rilevazione di DNA di contaminanti indesiderati, anche se sono dispersi in matrici alimentari/mangimistiche ad abbondante contenuto di DNA, grazie allo sviluppo di fluorescenza rilevata da un apposito strumento

7 Cos'è la PCR Real-time? La PCR Real-time (qpcr) è una tecnica specializzata che permette di visualizzare in tempo reale la progressiva amplificazione di una reazione di PCR, attraverso uno strumento che rileva e misura la fluorescenza Come vedremo, la PCR Real-time permette di misurare sequenze di DNA presenti in piccole quantità all'interno di un campione

8 Le applicazioni della qpcr La qpcr è diventata una pietra miliare della biologia molecolare nella ricerca di base e nelle diagnosi cliniche. Alcuni esempi di utilizzo: Analisi dell'espressione genica (es. ricerca sul cancro e sulle droghe) Diagnosi e gestione delle malattie (es. quantificazione della carica virale) Miglioramento genetico di animali e piante Da un decennio la qpcr è anche utilizzata per l'indagine alimentare. Alcuni esempi di utilizzo: Identificazione di patogeni e di microorganismi alteranti Identificazione e quantificazione in percentuale degli OGM negli alimenti Verifica dell'autenticità dei prodotti alimentari Controllo e individuazione della presenza di allergeni nei prodotti alimentari Individuazione delle malattie negli animali da allevamento

9 Come funziona la PCR Real-time? Per capire meglio la PCR Real-time, entriamo nel dettaglio di come funziona in pratica un normale esperimento di PCR. Questo hamburger contiene soia anche se non è evidente? Estrazione del DNA DNA Soia DNA disperdente: grano, sesamo, manzo, insalata, cipolla, pomodoro

10 Allestimento della reazione di PCR Reagenti PCR: Enzima DNA polimerasi Primers dntps Buffer Aggiungere il DNA estratto in un tubo semplice (tubo PCR) Aggiungere i reagenti PCR nel tubo

11 Corsa della reazione PCR Reazione di amplificazione Inserire il tubo PCR nello strumento Lo strumento avvia dei cicli di riscaldamento e raffreddamento dei reagenti presenti nel tubo PCR Durante ogni ciclo il templato si duplica Alla fine del processo (solitamente cicli) la PCR ha amplificato la sequenza del DNA soia

12 Immaginiamo una PCR Real-time Per capire meglio la PCR Real-time, proviamo ad immaginarci all'interno del tubo di reazione durante i cicli Se partiamo da una singola copia di templato soia Ciclo 23 Ciclo 24 Ciclo 25 Un mix di reagenti PCR e 2 23 copie del templato soia ( copie) Un mix di reagenti PCR e 2 24 copie del templato soia ( copie) Un mix di reagenti PCR e 2 25 copie del templato soia ( copie)

13 Immaginiamo una PCR Real-time Se dovessimo tracciare la quantità di DNA presente nel nostro tubo, dall'inizio dell'esperimento fino al ciclo 25, il grafico dovrebbe assomigliare a questo (curva logistica): Ampliconi Cicli Ma con l'avanzamento della reazione i reagenti si esauriscono progressivamente, di conseguenza questa crescita esponenzale non può continuare per sempre!

14 Immaginiamo una PCR Real-time La cinetica complessiva di una reazione PCR è una curva sigmoidale. Questa cinetica può essere monitorata utilizzando dei reagenti che emettono fluorescenza in presenza di DNA amplificato! Fase di Plateau Ampliconi Fase lineare Fase esponenziale Cicli

15 Strumento della Real-time PCR Per una Real-time PCR occorrono TRE componenti principali: 1. Termociclatore (riscaldamento e raffreddamento del tubo PCR) 2. Modulo ottico (rilevazione della fluorescenza nel tubo PCR) 3. Computer (interpretazione dei dati di fluorescenza e loro trasformazione in risultati comprensibili) Dettaglio 3

16 Strumento della Real-time PCR Gli strumenti per la Real-time PCR possono rilevare più di una fluorescenza contemporaneamente (multiplex), quindi: 1. Possiamo avviare più di una reazione nello stesso tubo sullo stesso campione e la cinetica di queste reazioni viene analizzata indipendentemente utilizzando differenti reporter di fluorescenza (per esempio possiamo verificare simultaneamente la presenza di soia e di sedano nel DNA estratto dall'hamburger). 2. Possiamo aggiungere in ogni reazione PCR un controllo interno di amplificazione (IAC) per osservare eventuali inibizioni ed evitare risultati falsi negativi Target IAC Campione positivo Campione negativo Inibizione PCR

17 Calcolo delle quantità in Real-time PCR Dal momento che la PCR segue una esatta cinetica nella sua fase esponenziale: 1. Ad ogni curva si può individuare il punto di intersezione con una soglia arbitraria (threshold), valore definito "Valore Ct", ovvero il ciclo al quale la fluorescenza diventa significativamente rilevabile 2. L'aumento dei valori Ct è inversamente proporzionali alla quantità iniziale del DNA 3. Ad ogni ciclo di PCR si raddoppia la quantità di DNA rispetto al ciclo precedente (2 n dove n=numero di ciclo): ad esempio un estratto di DNA diluito serialmente 10 volte mostrerà una distanza di 3,2 Ct tra una diluizione e l'altra (10=2 3,2 ) threshold

18 Calcolo delle quantità in Real-time PCR Dal momento che è presente una corrispondenza tra distanza dei Ct e le diluizioni di DNA, la Real-time PCR consente una quantificazione accurata del target di interesse Se abbiamo materiale standard quantificato disponibile possiamo effettuare una curva di calibrazione traducendo quindi, attraverso interpolazione, una quantificazione relativa in una quantificazione assoluta, misurando così il campione incognito Valore Ct Punto Standard Campione incognito Logaritmo quantità

19 PCR Digitale Con la PCR digitale il DNA estratto viene messo in piccole gocce, ogni singola goccia si comporta come un singolo tubo PCR = DNA disperdente (15) = DNA soia (5) Risultati

20 PCR Digitale Se il DNA target è presente nella goccia, avviene la reazione PCR e si verifica la fluorescenza o in caso contrario rimane buio Contando il numero di gocce fluorescenti possiamo determinare il numero assoluto di DNA target presente nel campione di partenza (di seguito il grafico tipico) pozzi = Gocce positive = Gocce negative