La microbiologia di supporto alla gestione: rapidità ed innovazione

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1 CAP. 1 CAP. 2 La microbiologia di supporto alla gestione: rapidità ed innovazione dott.ssa de Lellis Laura HeraTECH- Sasso Marconi (BOLOGNA) CAP. 3 CAP. 4 CAP. 5

2 o o. o o Parametri microbiologici (per requisiti minimi) Escherichia coli Enterococchi Parametri indicatori Batteri coliformi Clostridium perfringens MICROBIOLOGIA «TRADIZIONALE» o Conte a 37 e 22 C Parametri supplementari o Alghe o Batteriofagi anti E.coli -Nematodi a vita libera o Salmonella o Funghi e Lieviti o Pseudomonas aeruginosa e Stafilococchi o Protozoi e altri elementi figurati o Attinomiceti o Spore di clostridi solfito-riduttori o Legionella MICROBIOLOGIA «INNOVATIVA»

3 2002 LABORATORI DISLOCATI IN PIU SEDI- UN SETTORE MICROBIOLOGIA per LABORATORIO LABORATORI PRINCIPALI UN SETTORE UNICO DI MICROBIOLOGIA 2017 LABORATORI HERATECH ACQUE POTABILI-NATURALI determinazioni ACQUE REFLUE-FANGHI 5500 determinazioni ARIA-SUPERFICI 2500 determinazioni SALMONELLE DETERMINAZIONI ANNUE POTABILI+NATURALI+REFLUE circa 500 TOSSICITA DETERMINAZIONI ANNUE POTABILI+NATURALI+REFLUE circa 2200

4 1 ANALISI TOSSICITA ACQUE POTABILI E REFLUE CON BATTERI BOLUMINESCENTI- ANALIZZATORE EASYCHEMTOX 2 AUTOMAZIONE NELLA GESTIONE DEI CAMPIONI E DEI RISULTATI ANALITICI 3 ANALISI SALMONELLA IN PCR

5 Analisi Salmonella nelle acque METODO TRADIZIONALE APAT IRSA 7080/ RAPPORTI ISTISAN 07/5 ISSA 011A FILTRAZIONE IN ACQUA PEPTONATA CRESCITA A 37 C (24h) PASSAGGIO IN RV (24h) PRIMA SEMINA SU PIASTRA DI HEKTOEN (24h) SECONDA SEMINA SU PIASTRA DI HEK (24h) IDENTIFICAZIONE E CONFERMA COLONIE SOSPETTE 4 giorni per campioni negativi 6-7 giorni per campioni positivi Test di conferma con terreni selettivi e test biochimici e/o sierologici con fasi a cadenza giornaliera METODO ALTERNATIVO PCR - RT FILTRAZIONE IN ACQUA PEPTONATA CRESCITA A 37 C (24h) REAZIONE DI PCR (3h tot) Conferme non necessarie Elevata specificità Maggiore sensibilità 0.1 UFC

6 Analisi Salmonella nelle acque La PCR (Polymerase chain reaction) è una metodica sensibile, veloce e versatile che consente di ottenere grosse quantità di materiale genetico a partire da piccole quantità di DNA. Permette di analizzare specifiche sequenze che altrimenti costituirebbero bersagli molto rari in un genoma complesso. E una reazione enzimatica di amplificazione in vitro di un segmento di DNA ottenuta tramite l enzima Taq polimerasi a partire da una coppia di primers (oligonucleotidi), sequenze di DNA a singolo filamento necessari per l innesco della reazione.

7 REAL-TIME PCR (PCR Quantitativa) Una zona specifica di DNA viene bersagliata con due oligonucleotidi che amplificano, tramite la reazione polimerasica, la zona stessa copiandola un enorme numero di volte e rendendola visibile e manipolabile per l analisi

8 Analisi Salmonella nelle acque Nel nostro sistema, automatizzato, la rilevazione dei frammenti amplificati avviene mediante registrazione dell emissione di fluorescenza durante la reazione di amplificazione, per ibridazione di sonde altamente specifiche- molecular beacons - marcate con molecole fluorescenti. Nel momento in cui si appaiano alla sequenza complementare, si aprono ed emettono il segnale di fluorescenza per allontanamento del fluoroforo dal suo inibitore (quencher): SI SEGUE ISTANTE PER ISTANTE L INDIVIDUAZIONE DEL PATOGENO Le prove sperimentali per valutare le prestazioni della PCR Real Time utilizzando il termociclatore Stratagene Mx3005P e il kit Rapid-Pathogen Detection system evidenziano: la maggiore sensibilità della tecnica rapidità-esito dell analisi di campioni di acqua con notevole anticipo rispetto alla metodica tradizionale.

9 PCR Real time per analisi Salmonella Accuratezza: elevata specificità e sensibilità con livelli di rilevazione migliori di quelli del metodo di riferimento Rapidità nell ottenimento del risultato (una notte di arricchimento e meno di tre ore per la reazione di detection) Facilità d uso: kit di analisi e software semplice, utilizzo di strips pratiche, adatte ad un impiego routinario in laboratorio, tutte le fasi visualizzabili a video, risultati che non necessitano di interpretazioni soggettive Migliore gestione dei campioni vista la possibilità di conservarli in frigo per una settimana Migliore tracciabilità dei dati grazie all archivio informatico di tutte le fasi analitiche.

10 PCR Real time per analisi Salmonella COLLABORAZIONE UNIBO Per verificare i margini di ottimizzazione del funzionamento/gestione di bacini depurativi al fine della rimozione dei macronutrienti e dei patogeni ANALISI di parametri di processo (macronutrienti: azoto e fosforo - microbiologici: E.coli e Salmonella) nei bacini di finissaggio nello stato di fatto e nell impianto pilota appositamente costruito per simulare variazioni di battente idraulico e di tempi di ritenzione idraulici. SALMONELLA - ANALISI IN PCR possibilità di aumentare l efficienza e la garanzia di rimozione di questo patogeno Il piano di monitoraggio proposto rappresenta un primo screening e il primo step dell indagine per definire una base dati solida rappresentativa delle condizione di diffusione della Salmonella nel periodo primaverile-estivo.

11 Per stabilire la tossicità di prodotti e sottoprodotti delle attività umane - sostanza note, miscele (rifiuti- fanghi) o acque di scarico - per un determinato ECOSISTEMA si utilizzano Test su bioindicatori allevati in laboratorio Analisi tossicità Nessuna metodologia chimica è in grado di stabilire quale sia la frazione realmente biodisponibile e quindi in grado di interagire con il biota Daphnia magna-crostaceo cladocero Riproduzione: partenogenetica (condizioni ottimali) anfigonica o sessuale (condizioni limitanti) Buon indicatore: breve ciclo vitale e buona capacità riproduttiva Esposizione degli organismi a diverse concentrazioni del campione in esame per una durata di 24/48 ore Viene utilizzato per diverse tipologie di matrici, sostanze chimiche note (mg/l), acque di scarico e superficiali (%), rifiuti (% o mg/l) e fanghi (mg/l) Endpoint: morte /immobilizzazione del crostaceo

12 Analisi tossicità ANALISI TOSSICITA CON DAFNIA MAGNA ALLEVAMENTO ANALISI TOSSICITA CON VIBRIO FISCHERI- METODO AUTOMATICO ANALISI TOSSICITA CON DAFNIA MAGNA EFIPPI COMMERCIALI ANALISI TOSSICITA CON VIBRIO FISCHERI- METODO MANUALE

13 Analisi tossicità con Vibrio fischeri La bioluminescenza emessa dai batteri marini gram negativi della specie Vibrio fischeri (ceppo NRRL-B-11177) viene utilizzata per un saggio a 5-15 e 30 minuti Secondo la UNI EN ISO :2009 il risultato dell analisi con Vibrio fischeri è una concentrazione di effetto (EC50-EC20) La diminuzione di luminescenza viene ritenuta proporzionale alla tossicità del campione

14 Gli effetti ottenuti possono essere: Analisi tossicità con Vibrio fischeri NON TOSSICO -bioluminescenza invariata o diminuzione minore del 10% nel campione tal quale TOSSICO misurabile - diminuzione di bioluminescenza contenuta tra 10 e 90 % nelle diverse diluizioni del campione estremamente TOSSICO -bioluminescenza assente nel campione Se il campione tal quale dà un'inibizione <10 % allora l EC50 non è calcolabile, il campione è non tossico, e il risultato analitico è EC 50 > 100% o non calcolabile. Se l inibizione è compresa tra 10 e 90% è invece possibile calcolare un valore finito di EC 50, che sarà il risultato da fornire al gestore.

15 Analisi tossicità con Vibrio fischeri

16 Analisi tossicità con Vibrio fischeri

17 Automazione nella gestione campioni e risultati La procedura ha permesso di velocizzare e rendere più sicura la gestione dei campioni e più rapida la fase di inserimento dei risultati analitici Fase di preparazione: In questa fase è prevista la stampa delle etichette, da apporre sulle relative piastre. Sono riportate tutte le informazioni delle analisi del Piani di lavoro di MICROBIOLOGIA. Fase di inserimento risultati: E prevista una maschera, a più schede, per la gestione dei risultati, con acquisizione tramite lettura dei barcode

18 Algae Online Analyser Il laboratorio HERAtech ha individuato l impianto pilota Algae Online Analyser, in grado di monitorare e quantificare in continuo la biomassa algale e cianobatterica tramite la fluorimetria in vivo in acque grezze, di processo e potabili. Il principio si basa sull analisi dello spettro di fluorescenza emesso dai pigmenti dopo averli sottoposti ad eccitazione per mezzo di una luce di lunghezza d onda compresa tra 400 e 650 nm Viene determinata la clorofilla e l attività fotosintetica; è in grado di discriminare simultaneamente fino a 5 classi algali (Clorofite, Cianobatteri, Crisofite e Criptofite) utilizzando sei LED a diverse frequenza.

19 Algae Online Analyser Limitata manutenzione (pistone interno per pulizia della camera) Semplice operatività Possibilità analisi campioni in sequenza Possibilità uso off line Nessuna preparazione del campione o di reattivi Supporto al metodo tradizionale che comporta tempo ed elevata specializzazione per il riconoscimento al microscopio

20 Grazie per l attenzione