MICROBIOLOGIA: CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST DEL DNA E TOSSICITA. dott.ssa de Lellis Laura. Bologna, 12/10/2017

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1 MICROBIOLOGIA: CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST DEL DNA E TOSSICITA dtt.ssa de Lellis Laura Blgna, 12/10/2017

2 LABORATORI SETTORE MICROBIOLOGIA TEST DNA - ANALISI SALMONELLA spp. TOSSICITA - VIBRIO FISHERI

3 MICROBIOLOGIA: CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST del DNA E TOSSICITA MICROBIOLOGIA «TRADIZIONALE» MICROBIOLOGIA INNOVATIVA Metdiche classiche Metdi qualitativi Metdi quantitativi: cnteggi UFC Metdi semiquantitativi: MPN Metdiche alternative Metdiche bimleclari quali Real Time PCR (Salmnella spp, Leginella, entervirus...) L impieg di metdi d analisi alternativi è accettabile quand tali metdi sian validati in base al metd di riferiment. 3

4 MICROBIOLOGIA :CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST del DNA Settre Micrbilgia Analisi acque POTABILI Analisi acque REFLUE Analisi fanghi DL 31 Decret Legislativ 2 febbrai 2001, n. 31: Attuazine della direttiva 98/83/CE relativa alla qualità delle acque destinate al cnsum uman» Decret 14 giugn 2017 del Minister della Salute, di recepiment della direttiva (UE) 2015/1787 Parametri micrbilgici Enterccchi Escherichia cli Parametri indicatri Batteri clifrmi Clstridium perfringens Cnte a 37 e 22 C MICROBIOLOGIA «TRADIZIONALE» Parametri accessri Alghe Batterifagi anti E.cli -Nematdi a vita libera Salmnella Funghi e Lieviti Pseudmnas aeruginsa e Stafilccchi Prtzi e altri elementi figurati Attinmiceti Spre di clstridi slfit-riduttri Leginella SBI (sludge bitic index) Batteri filamentsi 4

5 MICROBIOLOGIA: CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST del DNA Perché utilizzare un metd alternativ? Più rapid Ridtt impieg di persnale Ridtt us di reagenti Miglire perfrmance Multitarget Patgeni emergenti Intervent in situazini di emergenza Cme prcedere Individuare il metd più adatt Valutare la pssibilità di utilizzare kit prnti presenti in cmmerci Applicare in labratri Validare il metd Accreditare la prva SALMONELLA spp. nelle acque Metd M10R Acque: Ricerca di Salmnella spp. Tecnica: RT-PCR------Accreditat---- EFFETTUARE la VERIFICA DELLE PERFORMANCE IN LABORATORIO 5

6 MICROBIOLOGIA: CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST del DNA SALMONELLA spp. nelle acque Metd M10R Acque: Ricerca di Salmnella spp. Tecnica: RT-PCR------Accreditat---- Prtcll intern di validazine (verifica di sensibilità, dei tempi di analisi, applicabilità in labratri per csti e frmazine del persnale cinvlt) Ricerca di salmnella in ambiente idric i vantaggi della PCR real time 2011 Energia e Ambiente ggi Prcess di accreditament IL METODO ACCREDITATO DAL LABORATORIO sfrutta la PCR-RT : Tempi di rispsta NOTEVOLMENTE DIMINUITI Prcedura e lettura autmatica (minr errre uman) Kit prnti all us (miglire gestine reagenti a magazzin) Sistema miniaturizzat che riduce i rifiuti speciali Pssibilità di effettuare l analisi in emergenza cn tempi di rispsta di 24 re 6

7 MICROBIOLOGIA : CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST del DNA COSA E LA RT-PCR (REAL-TIME PCR). Metdica sensibile, velce e versatile che cnsente di ttenere grandi quantità di materiale genetic da piccle quantità di DNA. Analizza specifiche sequenze che altrimenti cstituirebber bersagli rari in un genma cmpless. Reazine enzimatica di amplificazine di un segment di DNA a partire da una cppia di primers necessari per l innesc di reazine. Una zna specifica di DNA viene amplificata, cpiandla un enrme numer di vlte e resa visibile e maniplabile per l analisi. 7

8 MICROBIOLOGIA CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST DNA LABORATORIO Termciclatre Stratagene Mx3005P kit Rapid-Pathgen Detectin system AOAC Certificate f Perfrmance Tested SM Status N ADIAFOOD Rapid Pathgen Detectin System fr Salmnella IL DNA amplificat viene rilevat in temp reale dall strument: nn è prevista nessuna maniplazine pst-amplificazine. Il sistema real-time permette di. rilevare fin a 1 cpia di DNA per campine prevede un cntrll intern per mnitrare in md sicur il prcess di amplificazine evidenzia eventuali falsi negativi (inibitri di reazine) 8

9 MICROBIOLOGIA : CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST DNA Sistema autmatizzat: rilevazine dei frammenti amplificati per registrazine di emissine di flurescenza (ibridazine di snde specifiche marcate cn mlecle flurescenti). METODO TRADIZIONALE - APAT IRSA 7080/ - RAPPORTI ISTISAN 07/5 ISSA 011A METODO ALTERNATIVO PCR - RT Nel mment in cui si appaian alla sequenza cmplementare, emettn il segnale di flurescenza SI SEGUE ISTANTE PER ISTANTE L INDIVIDUAZIONE di SALMONELLA - FILTRAZIONE IN ACQUA PEPTONATA - CRESCITA A 37 C (24h) - PASSAGGIO IN RV (24h) - SEMINA SU PIASTRA DI HEKTOEN (24h+24h) - IDENTIFICAZIONE E CONFERMA di COLONIE SOSPETTE - FILTRAZIONE IN ACQUA PEPTONATA - CRESCITA A 37 C (24h) - REAZIONE DI PCR (3h tt) Test di cnferma test bichimici e/ sierlgici ESITO 4 GIORNI PER NEGATIVI 6 GIORNI PER POSITIVI CONFERME NON NECESSARIE ESITO 2 GIORNI PER NEGATIVI E POSITIVI 9

10 MICROBIOLOGIA : CONTROLLI BATTERIOLOGICI CON TEST del DNA PUNTO DI FORZA: METODO ALTERNATIVO CHE PERMETTE SUPPORTO / CONSULENZA AL CLIENTE IN TEMPI RAPIDI ACCURATEZZA: ELEVATA SPECIFICITÀ E SENSIBILITÀ, LIVELLI DI RILEVAZIONE MIGLIORI DI QUELLI DEL METODO DI RIFERIMENTO RAPIDITÀ DEL RISULTATO: ELIMINAZIONE DELLA PREPARAZIONE DI TERRENI DI COLTURA E DI PROVE DI CONFERMA; ESITO IN ORE FACILITÀ D USO: KIT DI ANALISI COMPLETI, SOFTWARE SEMPLICE, FASI DI ESTRAZIONE E CICLI VISUALIZZABILI A VIDEO, RISULTATI CHE NON NECESSITANO DI INTERPRETAZIONI SOGGETTIVE MIGLIORE TRACCIABILITÀ DEI DATI: ARCHIVIO INFORMATICO DI TUTTE LE FASI ANALITICHE Cme prcedere nel prssim futur. Sistema unic di applicazine RT-PCR per: screening Leginella ricerca di entervirus Salmnella spp. 10

11 LABORATORI SETTORE MICROBIOLOGIA TEST DNA - ANALISI SALMONELLA spp. TOSSICITA - VIBRIO FISHERI

12 MICROBIOLOGIA : CONTROLLI BATTERIOLOGICI TEST del DNA E TOSSICITA Per stabilire la tssicità di prdtti e sttprdtti delle attività umane - sstanza nte, miscele (rifiuti- fanghi) acque di scaric - per un determinat ECOSISTEMA si utilizzan: Test su biindicatri allevati in labratri Daphnia magna crstace cladcer Bun indicatre: breve cicl vitale Diverse tiplgie di matrici, sstanze chimiche (mg/l), acque di scaric e superficiali (%), rifiuti (% mg/l) e fanghi (mg/l) Espsizine a diverse cncentrazini del campine in esame: 24/48 re Endpint: mrte/immbilizzazine Perché utilizzare il metd alternativ di analisi cn vibri? 12

13 METODI UTILIZZABILI nel LABORATORIO MICROBIOLOGIA : TOSSICITA TOSSICITA CON DAFNIA MAGNA ALLEVAMENTO TOSSICITA CON VIBRIO FISHERI- METODO AUTOMATICO TOSSICITA CON DAFNIA MAGNA EFIPPI COMMERCIALI TOSSICITA CON VIBRIO FISHERI- METODO MANUALE ANALISI TOSSICITA Metd UNI EN ISO : Effett inibitri sull emissine di luce di Vibri fisheri - Parte 3: metd cn batteri lifilizzati -----in attesa di frmale accreditament visita ispettiva

14 MICROBIOLOGIA : TOSSICITA NORMATIVA DLgs 152/06 allegat 5: «il saggi effettuat utilizzand batteri biluminescenti è previst tra i pssibili saggi, ltre a quell cn Daphnia magna, per l analisi della tssicità» Il Saggi di Tssicità nn è prescrittiv ai termini di legge, ma è un parametr indicatre per segnalare la necessità di eventuali ed ulteriri indagini analitiche. PARAMETRO Daphnia magna Vibri fisheri VALUTAZIONE TOSSICITA Immbilizzazine >50% (scaric in acque superficiali) Immbilizzazine >80% (scaric in rete fgnaria) Cncentrazine di effett EC50<100% LABORATORIO Prtcll intern di validazine Prcess di accreditament 14

15 MICROBIOLOGIA : TOSSICITA LABORATORIO Easychem tx: analizzatre a lettura diretta per analisi tssicità in autmatic Batteri selezinati e lifilizzati in md da garantirne un utilizz cntinuativ (mantengn per sei girni un segnale di biluminescenza misurabile e un inalterata sensibilità ai cmpsti tssici definiti nella nrma). Le cinetiche di luminescenza sn visualizzabili in frma grafica aggirnate in temp reale, integrate da una tabella dei risultati Sn calclati i valri di inibizine medi, la deviazine percentuale dalla luminescenza media finale dei singli bianchi e la stabilità dei segnali Cicli analitici, frequenza, parametri e limiti del cntrll qualità sn prgrammabili e gestiti in frma autmatizzata L strument cnserva memria di tutte le single letture di luminescenza eseguite 15

16 MICROBIOLOGIA : TOSSICITA VIBRIO FISHERI La biluminescenza emessa dai batteri marini Vibri fisheri viene utilizzata per il saggi a 5,15 e 30 minuti, sfruttand la prprzinalità tra diminuzine di luminescenza e tssicità del campine. Secnd la UNI EN ISO :2009 il risultat dell analisi è una cncentrazine di effett (EC 50 - EC 20): NON TOSSICO - biluminescenza invariata diminuzine minre del 10% INIBIZIONE <10%: EC50 nn calclabile, Campine nn tssic INIBIZIONE cmpresa tra 10 e 90% EC50 calclabile Campine tssic TOSSICO misurabile diminuzine di biluminescenza cntenuta tra 10 e 90 % nelle diverse diluizini estremamente TOSSICO - biluminescenza assente 16

17 MICROBIOLOGIA : TOSSICITA EC 50 CALCOLATA 17

18 MICROBIOLOGIA : TOSSICITA PUNTO DI FORZA: METODO ALTERNATIVO AUTOMATIZZATO CHE FACILITA E VELOCIZZA L ATTIVITA LAVORATIVA RAPIDITÀ DEL RISULTATO FINO A 60 CAMPIONI ANALIZZABILI CONTEMPORANEAMENTE ANALISI DEL SINGOLO CAMPIONE IN 30 MINUTI MIGLIORE GESTIONE DEL LAVORO POSSIBILITÀ DI CONSERVARE I CAMPIONI CONGELATI FACILITÀ D USO SISTEMA AUTOMATICO (DILUIZIONI, ANALISI DELLA BIOLUMINESCENZA, CALCOLO DEL RISULTATO E DELL INTERVALLO DI INCERTEZZA ) TRACCIABILITÀ DEI DATI ARCHIVIO INFORMATICO DI TUTTE LE FASI ANALITICHE 18

19 Grazie per l attenzine.