BIOLOGIA MOLECOLARE: introduzione alle tecniche e alle loro applicazioni cliniche

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1 I T A L B I O F O R M A i n c o l l a b o r a z i o n e c o n O R D I N E N A Z I O N A L E D E I B I O L O G I o r g a n i z z a i l c o r s o d i a g g i o r n a m e n t o BIOLOGIA MOLECOLARE: introduzione alle tecniche e alle loro applicazioni cliniche (II edizione) 5 O T T O B R E F A C O L T À D I S C. B I O L O G I C H E U N I V E R S I T À D E G L I S T U D I D I P E R U G I A - V I A F A I N A 2 P R E M E S S A La biologia molecolare e le tecniche ad essa connesse sono materia altamente specialistica in continua evoluzione ed avranno un sempre maggiore impatto nell'attività di diagnostica di laboratorio. La diagnosi molecolare trova già oggi estesa applicazione in Microbiologia (ricerca qualitativa e/o quantitativa di acidi nucleici virali) e sull uomo; la conclusione del sequenziamento del genoma umano consentirà di migliorare la conoscenza dei meccanismi molecolari alla base di numerose malattie. O B I E T T I V O S P E C I F I C O La biologia molecolare e le tecniche ad essa connesse sono materia altamente specialistica in continua evoluzione ed avranno un sempre maggiore impatto nell attività di diagnostica di laboratorio. La diagnosi molecolare trova già oggi estesa applicazione in Microbiologia (ricerca qualitativa e/o quantitativa di acidi nucleici virali) e sull uomo; la conclusione del sequenziamento del genoma umano consentirà di migliorare la conoscenza dei meccanismi molecolari alla base di numerose malattie. Sulla base di questa premessa l evento si propone di fornire nozioni di base, teoriche e pratiche, sulla struttura degli acidi nucleici, sulle modalità di replicazione, sulle metodiche biomolecolari utilizzate ai fini diagnostici nei laboratori biomedici (fase di estrazione, tecniche di amplificazione e di rilevazione, aspetti organizzativi). D E S T I N A T A R I Il corso si rivolge a Medici, Biologi, Chimici e Tecnici Sanitari di Laboratorio Biomedico. Verranno accettate fino ad un massimo di 60 iscrizioni. 1/7

2 R E S P O N S A B I L I S C I E N T I F I C I D E L P R O G R A M M A Antonio Goglio Direttore del Dipartimento Prevenzione e Sorveglianza e del Laboratorio di Microbiologia e Virologia dell A.O. Ospedali Riuniti di Bergamo Professore a Contratto Presso la Scuola di Specialità in Microbiologia e Virologia dell Università di Milano- Direttore Scientifico di Italbioforma Giuseppe Banfi Professore Associato di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Facoltà di Medicina Università di Milano - Direttore Sanitario Istituto Ortopedico Galeazzi di Milano Responsabile Struttura Formativa Italbioforma P R O G R A M M A h Registrazione partecipanti h Presentazione del corso h Strutture degli acidi nucleici, codice genetico e replicazione del DNA Paolo Amboni h L origine della polymerase chain reaction (PCR) e descrizione della metodica Paolo Amboni h Estrazione di DNA e RNA da diversi materiali: dai metodi manuali agli estrattori automatici Maria Iascone h b r e a k h Tecniche per la rilevazione dei prodotti di PCR: dai metodi colorimetrici alla PCR real time Annapaola Callegaro h Descrizione ed applicazioni di tecniche di amplificazione diverse dalla PCR Annapaola Callegaro h p a u s a p r a n z o h L organizzazione del laboratorio di biologia molecolare: gli spazi, i percorsi, i controlli Maria Iascone h Applicazioni cliniche in microbiologia Annapaola Callegaro h b r e a k h Applicazioni cliniche in genetica medica Maria Iascone h Le prospettive: la tecnologia dei microarrays, la proteomica, la trascrittomica Eugenio Cesana h Compilazione collegiale del test di apprendimento Compilazione individuale della scheda di valutazione evento e chiusura dei lavori 2/7

3 R E L A T O R I Paolo AMBONI U.O. Laboratorio Analisi Chimico Cliniche - Dipartimento di Patologia Clinica - A.O. Ospedali Riuniti di Bergamo Annapaola CALLEGARO U.S.C. Microbiologia e Virologia - A.O. Ospedali Riuniti di Bergamo Eugenio CESANA Laboratorio di Biologia e Genetica - Dip. di Scienze Pre-cliniche LITA VIALBA - Università di Milano Maria IASCONE USSD Laboratorio di Genetica Medica - A.O. Ospedali Riuniti di Bergamo S E G R E T E R I A O R G A N I Z Z A T I V A Italbioforma via F.lli Bandiera, 2/a S. Lorenzo di Parabiago (MI) Referente: Raffaella Gnocchi Cell Tel Fax e.mail: r.gnocchi@italbioforma.org In occasione di questo corso Italbioforma, su indicazione dell Ordine Nazionale dei Biologi, si avvarrà della collaborazione di: Saeco srl via Monte Acuto, Foligno (PG) Referenti: De Santis Alessandra Cell Bagaglia Francesco Cell Tel Fax e.mail: info@saecosrl.it Saeco srl fungerà da Segreteria Organizzativa di supporto in loco. C R E D I T I E C M Per tutte le categorie professionali cui il corso si rivolge, ovvero per i medici, biologi, chimici e tecnici di laboratorio, è stato richiesto e ottenuto l accreditamento ECM nazionale (Rif. ECM n /279894). Attribuiti n 6 crediti ECM per Medici, Biologi e Chimici e n 7 crediti per Tecnici sanitari di laboratorio biomedico Il rilascio della certificazione dei crediti è subordinato alla partecipazione effettiva all intero programma formativo (100% delle ore di formazione): l attestato ECM non verrà quindi rilasciato a chi volesse eventualmente lasciare l aula prima del termine previsto da programma. M O D A L I T À D I P A R T E C I P A Z I O N E Le iscrizioni al corso potranno essere effettuate con il pagamento della relativa quota direttamente sul sito nella sezione dedicata ai corsi residenziali, oppure tramite contatto con le Segreterie Organizzative. Il numero dei posti è limitato. Le iscrizioni verranno accettate secondo l ordine di arrivo: un contatore automatico reso attivo sulla pagina web dedicata alle iscrizioni consentirà di accettare le iscrizioni fino ad esaurimento dei posti disponibili. Se la procedura di iscrizione sarà portata a termine correttamente, l iscritto riceverà pochi minuti dopo la conclusione della medesima una di conferma dell avvenuta registrazione. In caso di mancata ricezione dell di conferma o di impossibilità ad effettuare l iscrizione on-line si suggerisce di contattare la Segreteria Organizzativa. 3/7

4 ATTENZIONE! 1) In caso di iscrizione da parte da parte di ASL ricordiamo che i pagamenti dovranno essere effettuati prima della data di realizzazione dell evento stesso. Qualora l ASL non fosse in grado di provvedere al pagamento all atto dell iscrizione il partecipante dovrà anticipare la quota. Sarà nostra premura provvedere al rilascio della fattura quietanzata intestata all ASL. Per l esenzione dell IVA è necessario che l ASL invii apposita richiesta alla Segreteria Organizzativa presso la sede di Italbioforma. 2) In fase di registrazione gli utenti dovranno avere a disposizione i dati corretti e completi per l intestazione della fattura che verrà regolarmente emessa a seguito del pagamento della quota di iscrizione: tali dati andranno inseriti nell apposita mascherina che compare nella terza schermata della procedura di iscrizione on-line. Per motivi amministrativi si comunica che saranno accettate esclusivamente le segnalazioni di eventuali variazioni relative ai dati per la fatturazione che perverranno prima o contestualmente al pagamento medesimo della quota. Q U O T A I N D I V I D U A L E D I I S C R I Z I O N E - 80,00 + IVA 20% = 96,00 per le iscrizione effettuate entro il termine del 23 settembre ,00 + IVA 20% = 108,00 per le iscrizioni che pervenissero oltre il termine ovvero dal 24/09 al 5/10 Informiamo che se, a pagamento effettuato, si dovesse rinunciare all iscrizione sarà possibile ottenere un rimborso del 50% della quota versata solo qualora la disdetta venga inoltrata alla Segreteria Organizzativa entro 7 giorni dalla data dell evento: oltre tale data non è previsto alcun rimborso così come non è previsto per le quote di iscrizione non usufruite per le quali non sarà giunta la rispettiva rinuncia entro il termine di cui sopra. E tuttavia possibile, in qualsiasi momento, provvedere alla sostituzione del nominativo dell'iscritto; le sostituzioni dovranno essere tempestivamente comunicate alla Segreteria Organizzativa. M O D A L I T À D I V E R I F I C A D E L L A P P R E N D I M E N T O I partecipanti saranno chiamati a compilare un questionario di verifica dell apprendimento ed una scheda di valutazione del corso con particolare attenzione ai seguenti aspetti: rilevanza degli argomenti, qualità educativa/di aggiornamento ed efficacia dell evento. La compilazione del test di apprendimento avverrà collegialmente in aula con discussione delle risposte dubbie mentre la compilazione della scheda di valutazione sarà individuale. A T T E S T A T O Ai Partecipanti sarà rilasciato un Certificato di Partecipazione valido per l inserimento nel curriculum formativo. S E D E Il corso avrà luogo presso aule della Facoltà di Scienze Biologiche dell Università degli Studi di Perugia - Via Faina n.2 4/7

5 ABSTRACT Strutture degli acidi nucleici, codice genetico e replicazione del DNA Il corso ha l'obbiettivo di dare le conoscenze di base sulla struttura e sulle funzioni degli acidi nucleici. Gli argomenti trattati saranno i seguenti: la struttura molecolare delle basi azotate con le relative caratteristiche chimico fisiche la composizione del DNA, la sua struttura molecolare e tridimensionale, e come questa ne determini le caratteristiche chimiche l'organizzazione del filamento di DNA all'interno dei procarioti e degli eucarioti Il codice genetico le modalità di trasmissione dell'informazione genetica sia di procarioti che eucarioti. la replicazione del DNA con particolare attenzione agli aspetti molecolari della forca replicativa i telomeri e le telomerasi la trascrizione e la maturazione del DNA Estrazione di DNA e RNA da diversi materiali: dai metodi manuali agli estrattori automatici Verranno trattati i vari metodi di estrazione degli acidi nucleici da diverse matrici biologiche. In particolare verranno affrontati tutte le problematiche che si possono incontrare durante tali procedure e i vari accorgimenti per poter valutare il recovery di DNA e la presenza di eventuali inibitori presenti nel campione che lo rendono non idoneo. Saranno anche confrontati i metodi manuali con i nuovi metodi basati sull utilizzo di stazioni automatizzate (sistemi aperti e integrati). In particolare: - Estrazione e purificazione del DNA/RNA: principi teorici e aspetti pratici - Metodi di estrazione del DNA/RNA - Precauzioni da adottare lavorando con il DNA e RNA - Valutazione qualitativa/quantitativa e del grado di purezza del DNA/RNA - Conservazione del DNA/RNA L origine della PCR e descrizione della metodica A metà degli anni 80 Kary B. Mullis lavorò ad una innovazione tecnologica che avrebbe rivoluzionato l attività dei laboratori di ricerca e di diagnostica, e che trova applicazione nei diversi campi della medicina: la Polymerase Chain Reaction che consente di ottenere rapidamente milioni di molecole di DNA a partire da quantità minime, anche una singola copia, di acido nucleico. La PCR può essere definita come: una reazione di amplificazione in vitro di un segmento di DNA specifico o target, per mezzo di una DNA polimerasi. La reazione di PCR può essere considerata una trasformazione di reagenti in prodotti e i reagenti coinvolti sono: DNA target da amplificare Due primers oligonucleotidici a singolo filamento che, appaiandosi in modo specifico con il DNA target, forniscono gli elementi di innesco per la sintesi di una nuova molecola di DNA complementare al target. La DNA polimerasi, Taq polimerasi termostabile, ottenuta da Thermus acquaticus, che sintetizza il nuovo filamento di DNA I disessoribonucleotidi (dntps) per la nuova molecola di DNA. Sali minerali, la cui concentrazione dipende dalla specificità del processo di amplificazione. I parametri necessari per l amplificazione sono: Denaturazione del DNA target ad alta temperatura (94 C- 95 C) Annealing o appaiamento dei primers alla sequenza target ( 50 C-60 C) Estensione dei primers ed elongazione della nuova molecola di DNA (72 C) 5/7

6 L insieme di questi tre parametri viene chiamato ciclo e in una reazione di amplificazione vengono effettuati cicli. Poiché il nuovo DNA prodotto in un ciclo può funzionare da stampo per il ciclo successivo, il numero delle sequenze target di DNA viene raddoppiato ad ogni ciclo. Il cosiddetto effetto plateau è il punto in cui la reazione di amplificazione cessa di essere esponenziale. Uno dei grandi successi della PCR dipende dalla possibilità di amplificare anche piccolissime quantità di DNA presenti ad esempio nei campioni clinici,dell ordine di nanogrammi. Si possono amplificare segmenti di DNA molto piccoli e anche parzialmente degradati. E quindi una metodica estremamente sensibile e rapida. La PCR presenta però anche alcuni svantaggi.proprio perché si tratta di una metodica estremamente sensibile, vi la possibilità di false positività dovute alle contaminazioni dei campioni con DNA amplificati in precedenti reazioni di PCR ( Carry over ).Un altro svantaggio è la possibilità di falsi negativi dovuti alla prenza di inibitori della Taq polimerasi presenti nei campioni clinici. Alcuni di questi problemi con il tempo, la standardizzazione e l automazione della metodica sono stati parzialmente superati e la PCR svolge un ruolo decisivo nella diagnostica molecolare. Tecniche per la rilevazione dei prodotti di PCR: dai metodi colorimetrici alla PCR real time L ultima fase di una reazione di PCR riguarda la valutazione del prodotto di PCR stesso. Questa fase è molto importante perché permette di accertare che il frammento amplificato corrisponda esattamente alla sequenza bersaglio attesa. Uno dei primi e più semplici metodi utilizzati per la rivelazione del DNA amplificato consiste in una corsa elettroforetica su gel di agarosio e successiva colorazione con etidio bromuro e visualizzazione del DNA ai raggi UV. Per verificare però la specificità del prodotto ottenuto è necessaria una ibridazione con una sonda oligonucleotidica specifica. Per poter rivelare il prodotto dell ibridazione tra amplificato e sonda, uno dei due componenti deve essere marcato. Sono stati recentemente sviluppati metodi di ibridazione basati sull uso di specifiche sonde o primers di amplificazione marcati con traccianti enzimatici, fluorescenti, chemiluminescenti. Sono stati recentemente messi a punto dei sistemi di PCR in tempo reale o Realtime PCR che consentono di amplificare e contemporaneamente rivelare il DNA di interesse. La quantificazione dei prodotti di PCR avviene nella fase esponenziale della reazione determinando maggiore sensibilità e accuratezza del dosaggio. L automazione del processo riduce notevolmente i rischi di contaminazione da carry-over. Descrizione ed applicazioni di tecniche di amplificazione diverse dalla PCR La PCR (Polymerase Chain Reaction) è senza alcun dubbio la più conosciuta e la più utilizzata tra le tecniche di amplificazione degli acidi nucleici, esistono però numerose altre tecniche di amplificazione genica quali: la LCR(ligase Chain Reaction), Il NASBA (Nucleic Acid Sequenze Based Amplification), il TMA (Trascription Mediaded Amplification) ed il bdna (branched DNA). In questa breve relazione prenderemo in esame le caratteristiche di queste metodiche i loro punti di forza ed i loro limiti. L organizzazione del laboratorio di biologia molecolare: gli spazi, i percorsi, i controlli Verrà descritto quali sono gli spazi necessari secondo le normative europee per poter utilizzare tutte le strumentazioni necessarie per la biologia molecolare in campo diagnostico. In particolare sarà affrontato in modo esauriente tutte le precauzioni che devono essere prese per le reazioni di amplificazione. Applicazioni cliniche in microbiologia La diagnostica molecolare delle malattie infettive sta acquisendo un ruolo sempre più importante nel laboratorio di microbiologia clinica. Le applicazioni più significative sono: Valutazione della viremia plasmatica o a livello delle cellule del sangue periferico nelle infezioni virali ( HIV, HCV, HBV, CMV, EBV, altri virus erpetci) Monitoraggio dell efficacia della terapia antivirale Identificazioni di mutazioni associate a resistenza ai farmaci antiretrovirali nel genoma di HIV-1 Identificazione di ceppi batterici e della eventuale resistenza alla terapia antibiotica Rilevazione rapida di batteri a lenta crescita ( tubercolosi) 6/7

7 Applicazioni cliniche in genetica medica Verranno esposti i presupposti teorici e i principi pratici necessari all applicazione diagnostica delle metodiche di biologia molecolare in genetica medica. Verranno presentati esempi di applicazione tradizionale in campo oncologico come supporto alla diagnosi ed esempi più innovativi di metodiche molecolari per la predizione della prognosi e della risposta alla terapia del singolo paziente. Infine verranno illustrate le applicazioni nel campo delle malattie genetiche mendeliane e multifattoriali. Le prospettive: la tecnologia dei microarrays, la proteomica, la trascrittomica Verranno illustrati i princìpi su cui si basa la tecnologia dei microarrays per l analisi dei geni, dei profili di espressione genica e dei profili di espressione di proteine in diversi tipi di campioni biologici. Saranno descritte alcune delle piattaforme attualmente in uso per la genomica e trascrittomica ed altri sistemi di multiplexing messi a punto per l analisi di proteine del plasma. Saranno presentati i metodi per l analisi bidimensionale del repertorio proteico, sia in elettroforesi sia in cromatografia in diversi tipi di campioni biologici. Si darà anche ampio spazio alle applicazioni per lo studio del repertorio anticorpale in campioni di siero di soggetti normali e di soggetti affetti da malattie autoimmuni. 7/7