dott.ssa Sara Masci L'organizzazione del laboratorio di biologia molecolare: gli spazi, i percorsi, i controlli

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1 dott.ssa Sara Masci L'organizzazione del laboratorio di biologia molecolare: gli spazi, i percorsi, i controlli

2 Quando si progetta un laboratorio di BM bisogna rispettare dei criteri di sicurezza che tutelino l'operatore e che al tempo stesso garantiscano l' EFFICIENZA DEI RISULTATI. Copyright 2008 PresentationFx.com Redistribution Prohibited Image 2008 clix@sxc.hu This text section may be deleted for presentation.

3 La prima cosa da fare per ridurre il rischio di contaminazione (FP) è SUDDIVIDERE l'ambiente di lavoro in due blocchi separati: una zona di PRE-AMPLIFICAZIONE e una zona di POST-AMPLIFICAZIONE. Le due zone possono essere mantenute distinte ad es. con aree diverse e dedicate, non comunicanti distribuite lungo un corridoio comune. Copyright 2008 PresentationFx.com Redistribution Prohibited Image 2008 clix@sxc.hu This text section may be deleted for presentation.

4 Le aree di lavoro: AREA PRE AREA POST Area prep. Reagenti E mix di amplificaz. Area estrazione Acidi nucleici Area di amplificaz. Area post Amplificaz. E lettura Il lavoro va organizzato seguendo il sistema di flusso a senso unico dalla zona PRE alla zona POST amplificazione.

5 CONTROLLO DELLE CONTAMINAZIONI La sensibilità della PCR talvolta può essere un problema (amplifica la sequenza bersaglio generando trilioni di copie). Il saggio infatti è pericolosamente sensibile alla presenza nell'ambiente, sull'operatore o sugli strumenti di molecole di DNA provenienti da precedenti amplificazioni.

6 Tipi di contaminazioni in agguato Carry-over: l'apertura di una provetta contenente l'amplificato può dar luogo ad un aerosol che rende l'ambiente inutilizzabile per l'allestimento di una nuova reazione DNA esogeno: nel caso in cui vengano amplificate regioni del genoma umano anche l'operatore può essere fonte di contaminazione (cell. di desquamazione, capelli...)

7 Cross-contaminazione: si verifica durante l'allestimento della reazione, un campione positivo ne contamina uno negativo generando quindi un falso positivo.

8 PRECAUZIONI GENERALI: Per minimizzare il rischio di falsi positivi in seguito a contaminazione è necessario prendere una serie di precauzioni: 1) GLI AMBIENTI _ Tenere separate l'area di PRE- Amplificazione da quella di POSTamplificazione _Utilizzare strumenti, materiali e reagenti distinti

9 _ I campioni di DNA o RNA devono essere preparati in un'area distinta da quella in cui vengono manipolati i reagenti e da quella in cui vengono analizzati gli amplificati. 2) REAGENTI: è buona norma aliquotare i reagenti utilizzati per la PCR ( tampone, primers, nucleotidi, enzima) _ tutti i reagenti devono essere preparati, aliquotati e conservati in un'area in cui non ci sono prodotti amplificati.

10 3) PIPETTE: le normali pipette per puntali monouso usate comunemente in laboratorio sono fonte di contaminazione. Si possono formare infatti aerosol contenenti frammenti di DNA che possono essere trasportati in campioni negativi. Per eliminare questa cross-reazione è necessario l'uso di pipette con puntali contenenti un filtro (barriera tra campione e pipetta) o pipette ad espulsione positiva con puntali dotati di pistone.

11 N.B. E' ASSOLUTAMENTE INDISPENSABILE UTILIZZARE SET DI PIPETTE DISTINTI NELLE DIVERSE AREE.

12 4) TECNICA LABORATORISTICA In tutte le varie fasi: Cambio frequente guanti Apertura attenta provette per minimizzare aerosol ( short spin) Aggiungere il campione come ultimo ingrediente della mix Chiudere la provetta dopo aver dispensato il campione e prima di passare al successivo Pulire le superfici di lavoro con prodotti detergenti specifici.

13 CONTROLLI Come in tutte le tecniche laboratoristiche è necessario allestire sia un C+ che un C- per evidenziare eventuali falsi positivi. IL CONTROLLO POSITIVO Non deve avere troppe copie bersaglio o costituirebbe una pericolosa fonte di contaminazione ( generando quantità enormi e non necessarie di sequenze di DNA)

14 CONTROLLI Generalmente il controllo positivo è costituito da un plasmide contenente la sequenza bersaglio e sono sufficienti molecole per ottenere un segnale positivo dopo l'amplificazione. IL CONTROLLO NEGATIVO Nell'allestimento di ogni reazione è necessario aggiungere uno o più controlli negativi, interposti fra i campioni.

15 _Nell'allestimento del controllo negativo vanno messi tutti i componenti della miscela di PCR tranne il DNA bersaglio. Oltre questi, può essere aggiunto un campione sicuramente negativo. _Per controllare la specificità, può essere utile includere anche controlli contenenti sequenze di DNA che non corrispondono alla sequenza da amplificare.

16 INATTIVAZIONE DEL DNA AMPLIFICATO Può avvenire a due livelli: durante l'allestimento di una nuova reazione (inattivazione pre-pcr) o al termine della reazione, prima della fase di rivelazione dei prodotti amplificati (post-pcr)

17 INATTIVAZIONE pre-pcr Una di queste strategie è basata sui sistemi di restrizione-modificazione e di taglio-riparo delle cellule. Per poter distinguere il DNA bersaglio da quello derivante da precedenti PCR, nella miscela di reazione la deossitimidinatrifosfato (dttp) viene sostituita con la deossiuridinatrifosfato (dutp) che viene incorporata nel DNA amplificato.

18 Nell'allestimento di una nuova reazione viene aggiunto l'enzima N-glicosilasi (UNG) che prima dei cicli di amplificazione catalizza la rottura del legame fosfodiesterico dell'uracile dal deossiribosio nel DNA contaminante( eventualmente presente) lasciando intatto il DNA nativo contenente dttp. Il DNA risultante, privo degli uracili, è suscettibile all'idrolisi in soluzione alcalina (Tampone) e alle alte t.

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20 Altri metodi di inattivazione pre- PCR Irradiazione della miscela di reazione con raggi UV a bassa lunghezza d'onda (tra 254 e 300 nm per 20 min.) Digestione con DNAsi I o con enzimi di restrizione che taglino all'interno del frammento contaminante Tuttavia tali sistemi hanno dei limiti: Non efficaci per quantità superiori a 10³ molecole La miscela di reazione non deve contenere né la DNA polimerasi né il campione.

21 INATTIVAZIONE POST-PCR Inattivazione tramite modificazione fotochimica del DNA dopo l'amplificazione: la presenza nel filamento stampo di una base alterata, per via fotochimica, blocca l'estensione della Taq polimerasi. Alla miscela possono essere aggiunti reagenti in grado di rimanere stabili durante la PCR e poi, una volta foto-attivati, di formare degli adducts che impediscono al DNA di fare da stampo.

22 BIBLIOGRAFIA 1. Marin MG, ed. Diagnostica di laboratorio. Tecniche di amplificazione genica: dal laboratorio alla pratica clinica. Milano: Sorbona publ., Verna R. La diagnostica di laboratorio con i metodi della biologia molecolare. Padova: Piccin Editore, DNA Learning Center Academy (sito internet). 4. Labinformatica (sito internet) 5. Istruzione operativa del laboratorio di biologia molecolare dell' ospedale di Teramo.

23 GRAZIE PER L'ATTENZIONE!

24 Leggi e norme ISO applicabili ai laboratori di biologia molecolare Recepimento dec. Com. 2000/608/CE concernente le note orientative per la valutazione del rischio di cui all.to III della Direttiva 90/219/CEE sull impiego confinato di microrganismi geneticamente modificati. - Decreto 25/09/2001 Integrazione Allegato II parte B Decreto lgs 206/2001 concernente l impiego confinato di microrganismi geneticamente modificati.- Gazzetta Ufficiale 20/04/2006 Attuazione delle direttive 2004/9/CE e 2004/10/CE concernenti l ispezione e la verifica della buona pratica di laboratorio (BPL). - Decreto Legislativo n.50 del 2/03/2007 Sistemi di Gestione per la Qualita - Fondamenti e Terminologia UNI EN ISO 9000 Sistemi di Gestione per la Qualita - Requisiti UNI EN ISO 9001 Sistemi di Gestione per la Qualita -Linee guida per il miglioramento delle prestazioni UNI EN ISO 9004 Linee guida per gli audit dei sistemi di gestione per la qualita e/o di gestione ambientale UNI EN ISO 19011

25 Gestione per la Qualita - Indicatori e quadri di Gestione per la Qualita. Linee guida generali. - UNI Sistemi di Gestione per la Qualita - Linee guida per la soddisfazione del cliente e per la misurazione degli indicatori del processo. - UNI Sistemi biologici per la prova della sterilizzazione e dei processi di sterilizzazione. Sistemi particolari per sterilizzatrici a calore umido. - UNI EN Biotecnologie. Guida per la valutazione della purezza, dell attività biologica e della stabilità dei prodotti a base di microrganismi. - UNI EN Biotecnologie. Laboratori di ricerca, sviluppo e analisi. Livelli di contenimento di laboratori microbiologici, aree di rischio, situazioni e requisiti fisici di sicurezza. - UNI EN Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura UNI CEI EN ISO/IEC Biotecnologie. Laboratori di ricerca, sviluppo e analisi. Linee guida per le operazione dei laboratori di biotecnologie. - UNI EN 12741

26 Biotecnologie. Laboratori di ricerca, sviluppo e analisi. Linee guida per il trattamento, l inattivazione ed il controllo dei rifiuti. - UNI EN Biotecnologie. Attrezzature. Guida sulle procedure per il campionamento e l inoculazione. - UNI EN Biotecnologie. Criteri di prestazione per le prestazioni di sicurezza microbiologica. - UNI EN Biotecnologie. Criteri di prestazione per gli elementi filtranti e per i filtri. - UNI EN Biotecnologie. Attrezzature. Linee guida nelle procedure di prova per la tenuta. - UNI EN Biotecnologie. Criteri di prestazione per recipienti. Dispositivi di protezione alla pressione. - UNI EN