LABORATORIO DI GENETICA SUMMER SCHOOL 2014

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1 P a g i n a 1 LABORATORIO DI GENETICA SUMMER SCHOOL 2014 PROTOCOLLO DI ESTRAZIONE DEL DNA DA TESSUTI VEGETALI GenElute Plant Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich) CYQFjAB&url=https%3A%2F%2Fwww.sigmaaldrich.com%2Fcontent%2Fdam%2Fsigmaaldrich%2Fdocs%2FSigma%2FBulletin%2Fg2n70bul.pdf&ei=QueqU8uoLOaX1AXknoGwCg&us g=afqjcnfaw30t8brkefpmmwyyabpu9q-xeg

2 P a g i n a 2 AMPLIFICAZIONE DI FRAMMENTI SPECIFICI DI DNA MEDIANTE PCR Allestimento della miscela di amplificazione Utilizzando il DNA genomico di castagno proveniente dalle diverse piante amplificheremo tramite PCR (Polymerase Chain Reaction) lo stesso tratto di DNA (frammento di amplificazione) all interno del quale sono presenti delle differenze (polimorfismi). Utilizzeremo due coppie di primer (o inneschi), in grado di amplificare ciascuna una sequenza omologa presente nel DNA dei campioni raccolti (il castagno è diploide). Materiale fornito: PCR buffer 5X: Tris-HCl ph mM KCl 100 mm TritonX % MgCl2 7.5 mm miscela dei 4 nucleotidi trifosfato (dntp) 1 mm coppia di primer specifici (vedi sotto) 1 µm Taq DNA polimerasi 5 U Ogni gruppo di due persone prepara 1 reazione con il campione di DNA che ha estratto, diluito alla concentrazione di 5ng/µl e TENUTO IN GHIACCIO!!!! Per ogni campione di DNA dovrete avere 2 provette contenenti: Provetta 1 piccola (200uL) La PCR buffer mix 5X, contenente: tampone di reazione + TAQ DNA polimerasi + Nucleotidi trifosfato + coppia di primer per l amplificazione [allestire la reazione di PCR dentro questa provetta] Provetta 2 Soluzione di DNA genomico alla concentrazione di 5ng/ µl (da voi preparata). Preparazione della reazione di PCR Unire alla provetta 1: 1.5 µl della soluzione diluita di DNA genomico (provetta 2) µl volume finale Programma del Thermal-Cycler per la reazione di PCR: 94 C 4min 94 C 50s 50 C 50s x 35cicli 72 C 60s 72 C 7min 4 C X ore Inserire le provette nel thermalcycler e avviare la macchina. PRIMER CASTAGNO Nome seq Len Tm Size range N alleles EMCs38.F TTTCCCTATTTCTAGTTTGTGATG EMCs38.R ATGGCGCTTTGGATGAAC 18 CsCAT2.F GTAACTTGAAGCAGTGTGAAC CsCAT2.R CGCATCATAGTGAGTGACAG 20 CsCAT3.F CACTATTTTATCATGGACGG CsCAT3.R CGAATTGAGAGTTCATACTC 20

3 P a g i n a 3 VOSTRE NOTE:

4 P a g i n a 4 PREPARAZIONE DEL GEL DI AGAROSIO I frammenti di DNA amplificati tramite la PCR verranno separati tramite elettroforesi su gel di agarosio allo 1,5%. La migrazione elettroforetica del DNA verrà confrontata con quella di un campione di DNA contenente frammenti di dimensioni note, che verrà utilizzato come marcatore per determinare il peso molecolare dei vari frammenti amplificati. Materiale fornito: Agarosio TAE 10x 400 mm Tris-acetato a ph mm EDTA Loading dye 6X: 0.25% blu di bromofenolo 0.25% xilene cianolo 30% glicerolo in TE Marcatori di peso molecolare del DNA Preparazione di un gel di agarosio: Pesare l'agarosio calcolando la quantità in base al volume del gel che dovete fare (es. 100ml) e versarlo in una beuta Aggiungere il tampone TAE 1x Far sciogliere l'agarosio a 100 C o mediante microonde, lasciar raffreddare a circa 60 C Aggiungere bromuro di etidio (concentrazione finale 0.5 µg/ml) ATTENZIONE: il Bromuro d etidio è mutageno e tossico. Va maneggiato solo con i guanti. I puntali o altro materiale venuto a contatto con il Bromuro d etidio vanno scartati in appositi sacchetti. Tutte le operazioni successive all aggiunta di Bromuro d etidio vanno compiute con i guanti. Preparare il supporto per la formazione del gel, versare la soluzione di agarosio e introdurre il pettine per la formazione dei pozzetti Dopo che il gel si è solidificato, metterlo nella vaschetta per elettroforesi contenente tampone TAE 1x Togliere il pettine e aggiungere tampone TAE 1x fino a coprire i pozzetti

5 ELETTROFORESI DEI FRAMMENTI AMPLIFICATI MEDIANTE PCR P a g i n a 5 (attenzione il GEL contiene etidio bromuro e perciò va maneggiato solo con i guanti) Caricare 13l di ciascun campione nel pozzetto Caricare almeno 1 marcatore di peso molecolare Collegare i cavetti all'alimentatore stando attenti alla polarità Accendere l'alimentatore e far migrare il DNA a 120 Volt seguendo la corsa mediante i coloranti indicatori del tampone di caricamento fino che il più veloce non è migrato per circa 6-7 centimetri. Mettere il gel sul transilluminatore UV e fotografare Confrontare la migrazione del DNA amplificato con quella del marker di peso molecolare Sulla base della migrazione dei frammenti di DNA marker stabilire la lunghezza dei frammenti amplificati. Confrontare i risultati ottenuti da tutti. POZZETTO N CAMPIONE SAT_1 SAT_2 SAT_

6 P a g i n a 6 Campione Scheda raccolta materiale per analisi del DNA Innesto (alto/basso) Lat Lon Note Castagno 1A Alto Castagno 1B Basso Castagno 2A Alto Probabilmente questa pianta è solo porta-innesto. 4 fusti da accestimento. Castagno 2B Basso Castagno 3A Alto Castagno 3B Basso Castagno 4A Alto Castagno 4B Basso

7 P a g i n a 7 LOCALIZZAZIONE DEI CAMPIONI DI CASTAGNO RACCOLTI