Pellet cellulare. Vortexare per sec. Riscaldare il campione in un termoblocco per 10 min a 100 C

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1 PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent Guida Rapida Per informazioni sulla sicurezza far riferimento alla sezione Safety del PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent Protocol (PN ). Per tutti i reagenti in grassetto, leggere le MSDS e seguire le relative istruzioni di sicurezza. Indossare occhiali, camici e guanti protettivi. Per una lista dell equipaggiamento richiesto e raccomandato, materiali di consumo e reagenti, far riferimento a PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent Protocol. Da una coltura in piastra Da una brodocoltura Selezionare una piccola ansata di cellule o il bordo di una colonia di fungo filamentoso da una piastra di coltura Sospendere le cellule in 100 µl di PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent in una provetta da 2,0-ml, per microcentrifuga Pellet cellulare Vortexare per sec Riscaldare il campione in un termoblocco per 10 min a 100 C Centrifugare il campione per 3 min in una microcentrifuga alla velocità massima Trasferire il supernatante in una nuova provetta da microcentrifuga Il supernatante è pronto per la PCR Pipettare 1 ml di brodo di coltura contenente i batteri o i funghi in una provetta da 2,0-ml per microcentrifuga Centrifugare il campione per 3 min in una microcentrifuga alla velocità massima Aspirare e decantare il supernatante Aggiungere 100 µl di PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent e lisare Il pellet pipettando su e giù. Chiudere bene il tappo Possibile stopping point, (conservare at 4 C)

2 Per informazioni sulla sicurezza fare riferimento alla sezione Safety nella prefazione a Microseq S rdna Bacterial Identification Kits Protocol (PN ). Per tutte lo sostanze chimiche in grassetto, leggere le norme di sicurezza e seguire le istruzioni di uso. Indossare idonei occhiali, camici e guanti. Summary I due kit componenti Microseq S rdna Bacterial Identification Kit includono tutti i reagenti necessari per il sequenziamento delle prime 500 paia di basi del gene batterico per il RNA ribosomiale 16S (16S rdna). La sequenza di DNA che ne risulta viene analizzata e confrontata con un database di sequenze geniche batteriche di 16S rdna, utilizzando il software Microseq ID Analysis. Questa Quick Reference Card contiene procedure semplificate per l uso dei kit Microseq 500. Il Protocollo del kit Microseq S rdna Bacterial Identification (PN ) contiene procedure dettagliate. Contenuto dei kit Il sistema Microseq 500 comprende il kit di PCR (PN ) ed il kit di Sequenziamento (PN ). La tabella seguente descrive i componenti di ciascun kit. Kit Componenti Descrizione Microseq S rdna Bacterial Identification PCR Kit (PN ) Master mix per PCR Una provetta contenente PCR Master Mix 2X che è destinata all amplificazione di sequenze geniche del gene del rrna 16S a partire da DNA genomico batterico. Questa provetta contiene una quantità di Master Mix sufficiente per 50 amplificazioni in PCR, 5 controlli negativi e 5 controlli positivi DNA, controllo positivo Una provetta di DNA, controllo positivo (E. coli), a 1 ng/µl, sufficiente per effettuare 10 controlli positivi Controllo negativo (acqua) Una provetta di controllo negativo Microseq S rdna Bacterial Identification Sequencing Kit (PN Master mix per il sequenziamento forward ) Master mix per il sequenziamento reverse Due provette contenenti ciascuna mix sufficiente per 50 reazioni (50 di sequenziamento e 5 di controllo) Due provette contenenti ciascuna mix sufficiente per 50 reazioni (50 di sequenziamento e 5 di controllo)

3 indica i possibili punti di interruzione Estrarre il DNA genomico del batterio usando PrepMan TM Ultra Sample Preparation Reagent (PN ) Conservare il supernatante a 20 C Far riferimento al PrepMan TM Ultra Sample Preparation Reagent Protocol (PN ) o al di Microseq S rdna Bacterial Identification Kits Protocol (PN ) per informazioni più dettagliate a. Pipettare 495 µl di acqua nuclease-free (Ambion PN 9937) in una provettina da microcentrifuga da 1,5-mL b. Utilizzare 5 µl del supernatante del campione estratto con PrepMan Ultra, per ottenere una diluizione 1:100 c. Vortexare per miscelare la soluzione d. Conservare il supernatante batterico rimanente a 20 C La PCR è ottimizzata per l uso con circa 25 ng di DNA genomico Per preparare... Mescolare... Controlli negativi 15 µl del modulo PCR 15 µl di acqua nuclease-free Controlli positivi 15 µl del modulo PCR 15 µl di DNA di controllo. E. coli positivo Campioni 15 µl del modulo PCR 15 µl di soluzione di lavoro Tappare le provettine o sigillare la micropiastra a 96 pozzetti e inserirli nel termociclatore. a. Programmare il termociclatore 9600 in modalità emulazione 9600, come segue: Step Per 30 cicli** Estensione Step iniziale* Melt Anneal Estensione finale finale HOLD CICLI HOLD HOLD 90 C 10 min 95 C 30 sec 60 C 30 sec 72 C 45 sec 72 C 10 min 4 C * è necessario un riscaldamento iniziale per 10 min a 95 C per l attivazione della AmpliTaq Gold DNA Polymerase ** è possibile aumentare il numero dei cicli per aumentare la resa della PCR, questo può però causare un aumento del background del controllo negativo b. Tarare il volume di reazione a 30 µl e far partire l amplificazione c. Conservare il prodotto di PCR a 15/25 C fino al momento dell uso

4 Verificare la presenza del prodotto di PCR facendolo correre su gel di agarosio al 2%. 10 µl di prodotto di PCR per corsia sono sufficienti per rilevare la presenza di DNA amplificato dopo colorazione con bromuro di etidio Nota: L uso di E-gel al 2% (Invitrogen G ) permette una verifica rapida della presenza del prodotto di PCR. Leggere le norme di sicurezza fornite dal produttore prima di stoccare, manipolare o lavorare con materiali pericolosi Il controllo positivo ed i campioni dovrebbero presentare un prodotto di PCR compreso fra pb, a seconda della specie batterica. Il controllo negativo non deve presentare alcun prodotto di PCR Dopo la corsa su gel rimangono 20 µl di prodotto di PCR. Rimuovere dal prodotto di PCR i dntp non usati ed i primer usando uno dei prodotti seguenti: ExoSap-IT (USB PN 78200; Leggere le norme di sicurezza fornite dal produttore prima di stoccare, manipolare o lavorare con materiali pericolosi Montage PCR Filter Unit (Millipore PNUFC7 PCR50) Seguire accuratamente le indicazioni del produttore relative al volume di partenza per la purificazione a. In una provetta da microcentrifuga da 0,2 ml, o in un pozzetto di una piastra microtiter miscelare: 7 µl di prodotto di PCR purificato 13 µl di Sequencing Module b. Tappare le provette o sigillare la piastra e introdurli nel termociclatore a. Programmare il termociclatore 9600 in modalità emulazione 9600, usando le condizioni seguenti: Per 25 cicli Melt Anneal Estensione CICLI 96 C 50 C 60 C 10 sec 5 sec 4 min Step finale HOLD 4 C b. Tarare il volume di reazione a 20 µl e far partire l amplificazione c. Conservare i prodotti di amplificazione a 4 C overnight o a 20 C per non più di una settimana

5 Dopo i cicli di sequenziamento togliere i dye terminator ed i primer in eccesso utilizzando uno dei seguenti prodotti: Se la PCR è stata eseguita in... Usare... Provette da microcentrifuga DyeEx TM 2.0 Spin Kit (Qiagen PN 63204) Piastra a 96 pozzetti DyeEx 96 Kit (Qiagen PN 63181) Seguire le istruzioni allegate al kit a. accertarsi che lo strumento sia configurato secondo i parametri contenuti nella tabella seguente: Strumento Filtro Run Module Basecaller* DyeSet/Primer (Mobility File) 310 E Seq POP6 (1mL)E KB.bcp DTPOP6{BD}. mob Avant E StdSeq50_ POP6 KB.bcp KB_3100_POP6 (BD)v2.mob xl E LongSeq50_ POP7_1 KB.bcp KB_3730_POP7_ BDTv1.mob * Applied Biosystems raccomanda di usare, per basecaller e mobility file, i nomi elencati nella tabella con il software Data Collection 2.0(DC 2.0). Alcuni basecaller e mobility file destinati a precedenti versioni del software sono compatibili con il software DC 2.0. Essi sono elencati nell Appendice A del Microseq S rdna Bacterial Identification Kit Protocol (PN ) IMPORTANTE! E necessari usare l array dei capillari da 50 cm indipendentemente dallo strumento usato b. Spin down le provette da microcentrifuga contenenti i prodotti di PCR purificati c. Risospendere il DNA in 15 µl HI-DI TM Formamide (PN ) d. Eseguire la corsa di sequenziamento e. Trasferire i file al software Microseq Analysis Nota: La risospensione in formamide è procedura di caricamento raccomandata. In alternativa è possibile caricare direttamente sullo strumento da 10 a 20 µl dei prodotti di PCR. Questa procedura può tuttavia necessitare di essere ottimizzata. Per esempio, può essere necessario modificare il tempo di iniezione se il segnale è troppo alto

6 Per informazioni sulla sicurezza fare riferimento alla sezione Safety nella prefazione di Microseq Full Gene 16S rdna Bacterial Identification Kits Protocol (PN ). Per tutte lo sostanze chimiche in grassetto, leggere le norme di sicurezza e seguire le istruzioni di uso. Indossare idonei occhiali, camici e guanti. Summary Microseq Full Gene 16S rdna Bacterial Identification PCR Kit (PN ) e Microseq Full Gene 16S rdna Bacterial Identification Sequencing Kit (PN ) includono tutti i reagenti necessari per il sequenziamento del gene per il RNA ribosomiale 16S (16S rdna). La sequenza di DNA che ne risulta viene analizzata e confrontata con un database di sequenze geniche batteriche di 16S rdna, utilizzando il software Microseq ID Analysis. La Quick Reference Card contiene procedure semplificate per l uso dei kit Microseq Full Gene 16S rdna Bacterial Identification. Il Protocollo del kit Microseq Full Gene 16S rdna Bacterial Identification contiene procedure dettagliate. Contenuto dei kit Il sistema Microseq Full Gene 16S rdna Bacterial Identification comprende due kit: PCR e Sequenziamento. La tabella seguente descrive i componenti di ciascun kit. Kit Componenti Descrizione Microseq Full Gene 16S rdna Bacterial Identification PCR Kit (PN ) Master mix per PCR Tre differenti provette contenenti PCR Master Mix 2X. Ciascuna provetta è destinata all amplificazione di una specifica porzione del gene del rrna 16S a partire da DNA genomico batterico. Ciascuna provetta contiene una quantità di Master Mix sufficiente per 10 amplificazioni, 5 controlli negativi e 5 controlli positivi DNA, controllo positivo Una provetta di DNA, controllo positivo, a 1 ng/µl Controllo negativo (acqua) Una provetta di controllo negativo Microseq Full Gene 16S rdna Bacterial Identification Sequencing Kit (PN ) Master mix per il sequenziamento forward Master mix per il sequenziamento reverse Tre provette distinte contenenti mix sufficiente per 15 reazioni (10 di sequenziamento e 5 di controllo) Ciascuna provetta corrisponde ad una provetta di PCR Master Mix del kit PCR Tre provette distinte contenenti mix sufficiente per 15 reazioni (10 di sequenziamento e 5 di controllo) Ciascuna provetta corrisponde ad una provetta di PCR Master Mix del kit PCR

7 Indica i possibili punti di interruzione Estrarre il DNA genomico del batterio usando PrepMan TM Ultra Sample Preparation Reagent (PN ) Conservare il supernatante a 20 C Far riferimento al PrepMan TM Ultra Sample Preparation Reagent Protocol (PN ) o al di Microseq Full Gene 16S rdna Bacterial Identification Kits Protocol (PN ) per informazioni più dettagliate a. Pipettare 495 µl di acqua nuclease-free (Ambion PN 9937) in una provettina da microcentrifuga da 1,5-mL b. Aggiungere 5 µl di supernatante di PrepMan Ultra, ottenendo una diluizione 1:100 c. Vortexare per miscelare la soluzione d. Conservare il supernatante batterico rimanente a 20 C Il kit PCR è ottimizzato per l uso con circa 25 ng di DNA genomico batterico Nota: Se necessario fare altre diluizioni della soluzione di lavoro prima di eseguire la PCR per minimizzare l effetto degli inibitori della PCR Per preparare... Mescolare... Controlli negativi 15 µl Master Mix PCR 2x 15 µl di acqua nuclease-free Controlli positivi 15 µl Master Mix PCR 2x 15 µl di DNA di controllo. E. coli positivo Campioni 15 µl Master Mix PCR 2x 15 µl di soluzione di lavoro (diluizione:100) Nota: dovrebbero aversi tre provette per ciascun campione, uno per ciascuna delle tre PCR Master Mix del kit Microseq Full Gene PCR Tappare le provettine o sigillare la micropiastra a 96 pozzetti e inserirli nel termociclatore.

8 a. Programmare il termociclatore 9600 in modalità emulazione 9600, come segue: Step Per 30 cicli** Estensione Step iniziale* Melt Anneal Estensione finale finale HOLD CICLI HOLD HOLD 95 C 10 min 95 C 30 sec 60 C 30 sec 72 C 45 sec 72 C 10 min 4 C * è necessario un riscaldamento iniziale per 10 min a 95 C per l attivazione della AmpliTaq Gold DNA Polymerase ** è possibile aumentare il numero dei cicli per aumentare la resa della PCR, questo può però causare un aumento del background del controllo negativo b. Tarare il volume di reazione a 30 µl e far partire l amplificazione c. Conservare il prodotto di PCR a 15/25 C fino al momento dell uso Verificare la presenza del prodotto di PCR facendo correre 10 µl di campione su gel di agarosio al 2%. 10 µl di prodotto di PCR sono sufficienti per rilevare la presenza di DNA amplificato dopo colorazione con bromuro di etidio In alternativa usare E-gel al 2% (Invitrogen G ). Leggere le norme di sicurezza fornite dal produttore Il controllo positivo ed i campioni dovrebbero presentare 3 prodotti di PCR: 1 banda di pb e 2 bande di pb. Le dimensioni del prodotto possono variare a seconda della specie batterica. Il controllo negativo non deve presentare alcun prodotto di PCR Nota: se non si evidenziano prodotti di PCR la causa più probabile sono gli inibitori della PCR. Per ulteriori informazioni consultare la sezione Troubleshooting del protocollo Microseq Full Gene 16S rdna Bacterial Identification Kits

9 Dopo la corsa su gel rimangono 20 µl di prodotto di PCR. Rimuovere dal prodotto di PCR i dntp non usati ed i primer usando uno dei metodi seguenti consigliati da Applied Biosystems: ExoSap-IT (USB PN 78200; Seguire le istruzioni del produttore Montage PCR Filter Unit (Millipore PNUFC7 PCR50) Seguire accuratamente le indicazioni del produttore relative al volume di partenza per la purificazione a. In 2 provette da microcentrifuga da 0,2 ml, o in 2 pozzetti di una piastra microtiter miscelare: 7µL di prodotto di PCR purificato e 13µL della master mix forward di sequenziamento 7µL di prodotto di PCR purificato e 13µL della master mix reverse di sequenziamento b. Tappare le provette o sigillare la piastra e introdurli nel termociclatore IMPORTANTE! Aver cura di usare le master mix di sequenziamento forward e reverse corrispondenti alle master mix di PCR usate in precedenza Nota: dopo lo step di amplificazione si avevano 3 provette per campione (una per ciascuna delle 3 master mix di PCR). Adesso, preparando una reazione di sequenziamento forward ed una reverse, il numero totale delle provette sale a sei

10 a. Programmare il termociclatore 9600 in modalità emulazione 9600, usando le condizioni seguenti: Per 25 cicli Melt Anneal Estensione CICLI 96 C 50 C 60 C 10 sec 5 sec 4 min Step finale HOLD 4 C b. Tarare il volume di reazione a 20 µl e far partire l amplificazione c. Conservare i prodotti di amplificazione a 4 C overnight o a 20 C per non più di una settimana Dopo i cicli di sequenziamento togliere i dye terminator ed i primer in eccesso utilizzando uno dei seguenti prodotti: Se la PCR è stata eseguita in... Applied Biosystems raccomanda l uso di... Provette da microcentrifuga DyeEx TM 2.0 Spin Kit (Qiagen PN 63204) Piastra a 96 pozzetti DyeEx 96 Kit (Qiagen PN 63181) Seguire le istruzioni allegate al kit a. accertarsi che lo strumento sia configurato secondo i parametri contenuti nella tabella seguente: Strumento Filtro Run Module Basecaller* DyeSet/Primer (Mobility File) 310 E Seq POP6 (1mL)E KB.bcp KB_310_POP6_ BDTv1_ 50Std.mob 3100 E StdSeq50_ KB.bcp KB_3100_POP6_ 3100-Avant xl E POP6_1 LongSeq50_ POP7 KB.bcp BDTv1.mob KB_3730_POP7_ BDTv1.mob * Applied Biosystems raccomanda di usare, per basecaller e mobility file, i nomi elencati nella tabella con il software Data Collection 2.0(DC 2.0). Alcuni basecaller e mobility file destinati a precedenti versioni del software sono compatibili con il software DC 2.0. Far riferimento a Microseq ID Analysis Software Online help per maggiori informazioni riguardo alle convenzioni relativi ai nomi di basecaller e mobility file IMPORTANTE! E necessari usare l array dei capillari da 50 cm indipendentemente dallo strumento usato (prosegue nella pagina successiva)

11 b. Spin down le provette da microcentrifuga contenenti i prodotti di PCR purificati c. Risospendere il DNA in 15 µl di HI-DI TM Formamide (PN ) d. Eseguire la corsa di sequenziamento e. Trasferire i file al software Microseq ID Analysis IMPORTANTE! La risospensione in formamide è procedura di caricamento raccomandata. In alternativa è possibile caricare direttamente sullo strumento da 10 a 20 µl dei prodotti di PCR. Questa procedura può tuttavia necessitare di essere ottimizzata. Per esempio, può essere necessario modificare il tempo di iniezione se il segnale è troppo alto