ZytoLight SPEC ALK/EML4 TriCheck Probe

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1 ZytoLight SPEC ALK/EML4 TriCheck Probe Z Z (0.2 ml) 5 (0.05 ml) Per la rilevazione del riarrangiamento dei geni ALK- EML4 mediante ibridazione in situ fluorescente (FISH).... Dispositivo per uso diagnostico in vitro in base alle direttive EU 98/79/EC

2 Sonda polinucleotide marcata in fluorescenza per il rilevamento del riarrangiamento dei geni ALK-EML4. Pronto all uso Descrizione Prodotto: Contenuto: Prodotto: Sonda ZytoLight SPEC ALK/EML4 TriCheck Probe (PL74) in tampone di ibridazione. La sonda contiene polinucleotidi coniugati con un fluorocromo verde (ZyGreen, analogo alla FITC, eccitazione a 503 nm ed emissione a 528 nm) che marca sequenze mappate in 2p23 prossimale della regione di rottura del gene ALK, polinucleotidi coniugati con un fluorocromo arancio (ZyOrange, analogo alla Rodamina, eccitazione a 547 nm ed emissione a 572 nm) che marca sequenze in 2p23 distale della regione di rottura del gene ALK e polinucleotidi coniugati con un fluorocromo blu (ZyBlue, analogo al DEAC, eccitazione a 426 nm ed emissione a 480 nm) che marca il gene EML4 in 2p21. Z : 0.2 ml (20 reazioni considerando 10 μl di dispensazione per campione) Z : 0.05 ml (5 reazioni considerando 10 μl di dispensazione per campione) Specificità: La sonda ZytoLight SPEC ALK/EML4 TriCheck Probe (PL74) è progettata per rilevare il riarrangiamento che coinvolge il gene ALK in 2p23 e il gene EML4 in 2p21 in tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina tramite ibridazione in situ fluorescente. Stabilità/Conservazione: La sonda ZytoLight SPEC ALK/EML4 TriCheck Probe (PL74) deve essere

3 Utilizzo: Precauzioni: conservata a -16/-22 C al buio ed è stabile fino alla data indicata sull etichetta. Questo prodotto è un dispositivo per uso diagnostico in vitro (in base alle direttive EU 98/79/EC). L'interpretazione dei risultati deve essere effettuata da personale qualificato tenendo conto degli altri dati clinici e patologici del paziente nel contesto dell'anamnesi clinica. Leggere il manuale d uso prima dell utilizzo! Non usare i reagenti dopo la data di scadenza riportata sull etichetta. Questo prodotto contiene sostanze (in piccoli volumi e piccole concentrazioni) dannose per la salute. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Prendere le appropriate misure protettive (guanti monouso, occhiali protettivi, abbigliamento da laboratorio). Se i reagenti vengono in contatto con la pelle lavare abbondantemente con acqua. Principio del Metodo: La presenza di determinate sequenze di acido nucleico nelle cellule o nei tessuti può essere rilevata attraverso ibridazione in situ con l'utilizzo di sonde a DNA marcate. L'ibridazione induce la formazione di una struttura a doppio filamento (ibrido duplex) tra le sequenze presenti nel campione in analisi e la sonda. La formazione del duplex (con le sequenze cromosomiche delle regioni cromosomiche 2p23 e 2p21 nel campione) può essere visualizzata attraverso l'utilizzo di un microscopio a fluorescenza con filtri appropriati

4 Istruzioni: Il pretrattamento (sparaffinatura, proteolisi, post fissazione) piuttosto che l allestimento del campione dovrebbero essere ottimizzati dall utilizzatore a seconda della natura del campione e dei propri bisogni. Denaturazione e ibridazione 1. Utilizzare 10µl di ZytoLight SPEC ALK/EML4 TriCheck Probe (PL74) per ogni campione. Distribuire a piccole gocce sull'intera superficie evitando di concentrare in un unico punto. Alternativamente, aggiungere la sonda al centro di un coprioggetto e applicare il coprioggetto sull'area in esame. Un leggero riscaldamento della sonda e l'utilizzo di un puntale tagliato in punta semplificano l'operazione. 2. Evitare la formazione di bolle, coprire il campione con un vetrino copri oggetto (22 mm x 22 mm a seconda della dimensione del campione). Sigillare il vetrino copri oggetto con fixogum o con colla analoga. 3. Denaturare a 75 C (± 2 C) per 10 minuti utilizzando una piastra calda La temperatura di denaturazione può dipendere da vari fattori come la fissazione o l età del campione pertanto potrebbe essere necessaria l ottimizzazione di tale temperatura (73 C-77 C) 4. Trasferire i vetrini in una camera umida e ibridare overnight a 37 C in una stufa ventilata E importante che il campione (cellule o tessuto) non si asciughino durante l ibridazione E possibile condurre le fasi di denaturazione/ibridazione mediante l utilizzo di piastre a controllo automatico della temperatura come il ThermoBrite StatSpin.

5 Risultati Mediante l utilizzo di filtri appropriati, i segnali di ibridazione del gene ALK (2p23) appariranno verdi e arancioni mentre i segnali di ibridazione del gene EML4 (2p21) appariranno blu. In interfase, le cellule normali o le cellule senza riarrangiamento dei geni ALK-EML4 utilizzando il corretto set di filtri a doppia banda si distingueranno due segnali fusi verdi/arancio e uno verde ed uno arancione, e tramite il corretto utilizzo di set di filtri a banda singola saranno visibili due segnali blu distinti (vedere figura in basso, caso 1). In loci 2p21-23 affetti da inversione, si visualizzerà un segnale verde e uno arancio separati più un segnale blu addizionale. Ogni segnale verde e arancio sono co-localizzati da un segnale blu (vedere figura in basso, caso 2). In loci 2p21-23 affetti da inversione, con delezione di 5 -ALK si avrà la perdita di un segnale verde più un segnale blu addizionale. Ogni segnale arancio è co-localizzato da un segnale blu (vedere figura in basso, caso 3). Un segnale separato verde e un segnale separato arancio accompagnato da un numero normale di segnali blu indica una traslocazione del gene ALK senza il coinvolgimento del gene EML4 oppure, in caso di vicinanza dei due segnali verde-arancio, di non riarrangiamento dei loci 2p Al fine di valutare la specificità del segnale, ogni ibridazione dovrebbe essere effettuata assieme a dei controlli. Si consiglia l utilizzo di almeno un campione in cui dei geni ALK-EML4 sia noto. Particolare attenzione si deve prestare nella valutazione di cellule sovrapposte onde evitare falsi risultati tipo amplificazione del gene. A causa della de condensazione della cromatina, singoli segnali FISH possono apparire come piccoli cluster, comunque due o tre segnali della stessa dimensione, separati da uno spazio pari alla dimensione di un segnale, devono essere considerati come un unico segnale.

6 Bibliografia Kievits T, et al. (1990) Cytogenet Cell Genet 53: Koivunen JP, et al. (2008) Clin Cancer Res 14: Martelli MP, et al. (2009) Am J Pathol 174: Perner S, et al. (2008) Neoplasia 10: Rodig SJ, et al. (2009) Clin Cancer Res 15: Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992) ISBN ISBN Ultima versione: 5 Aprile 2011 (4.5) Marchi di fabbrica: ZytoVision e ZytoLight sono marchi di fabbrica della ZytoVision

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