Ele$roforesi. verso il catodo se hanno carica posi.va. Le par.celle si spostano. verso l'anodo se hanno carica nega.va

Transcript

1 Ele$roforesi L ele#roforesi è una tecnica anali.ca e separa.va basata sul movimento di par.celle cariche ele$ricamente quando immerse in un fluido per effe$o di un campo ele$rico applicato mediante una coppia di ele$rodi. Le par.celle si spostano verso il catodo se hanno carica posi.va verso l'anodo se hanno carica nega.va

2 L ele$roforesi su gel oltre a separare il DNA serve anche per la separazione di RNA, proteine e amminoacidi. È da tenere presente che proteine e amminoacidi presentano tra loro cariche diverse e quindi non si separeranno solo in base alla grandezza. Molto importante è, a tal proposito, lavorare a condizioni controllate di ph.

3 La mobilità delle molecole nel gel variano a$raverso alcuni parametri: le dimensioni delle molecole, le cariche, natura e concentrazione del mezzo ele$rofore.co, la conformazione delle molecole, la corrente applicata. La mobilità ele$rofore.ca, grandezza che esprime la tendenza di una specie chimica a muoversi all'interno di un campo ele$rico applicato, può essere ricavata sfru$ando l'equazione di Henry: dove è la mobilità ele$rofore.ca, è la costante diele$rica, il potenziale zeta, la funzione di Henry e la viscosità del solvente.

4 Il tampone di ele#roforesi è una soluzione salina che serve sia a condurre la corrente ele$rica che a controllare il ph durante l ele$roforesi. Il gel loading buffer (colorante + addensante), che si aggiunge ai campioni prima dell ele$roforesi, serve ad appesan.re i campioni, perme$endo la loro permanenza nei pozzet, e a fornire un marker visivo del progredire della corsa ele$rofore.ca. Dopo l ele$roforesi (o durante) le bande di DNA sono colorate con bromuro di e.dio (che si intercala alle molecole dell acido nucleico). Per sciogliere l agarosio, piu$osto che usare l acqua dis.llata, si usano soluzioni tamponate che consentono al DNA di muoversi uniformemente lungo il gel. Queste soluzioni hanno lo scopo, infat, di determinare e mantenere stabili il ph e la concentrazione di ioni del gel. TAE e TBE sono i tamponi più comunemente usa. per l ele$roforesi.

5 T sta per Tris consente il mantenimento di un valore costante di ph della soluzione; E sta per EDTA chela i ca.oni divalen., come il magnesio. Questo è importante, perché la maggior parte delle nucleasi richiede ca.oni divalen. per funzionare. A o B sta per acido Borico o Ace:co forniscono l appropriata forza ionica al tampone.

6 Il campione è in soluzione acquosa. Questa, essendo di densità pari a quella del tampone, non riuscirebbe ad impedire che il campione fuoriesca dal pozze$o. Questo è il mo.vo per cui si aggiunge al campione una sostanza addensante: glicerolo, saccarosio, Ficoll. Inoltre, per monitorare la migrazione nel gel, si aggiungono anche molecole coloran., di differen. colori e dimensioni. Il blu di bromofenolo, è più piccolo di quasi tu@ i frammen. di DNA quindi migrerà velocemente. Lo xilene cianolo, è una molecola grande, che migra insieme ai frammen. di più elevato peso molecolare. L'uso di un molecular weight (marcatore di peso molecolare), mi perme$e per confronto di avere informazioni sulle dimensioni dei frammen..

7 I frammen: di DNA, carichi nega.vamente per i residui di fosfato, in un campo ele$rico tendono ad andare verso il polo posi.vo. Si u.lizza una matrice di supporto molecolare cos.tuita da agarosio (o acrilammide se si vuole o$enere una maggiore risoluzione) I frammen. più piccoli passano più velocemente. I frammen. passano a$raverso le maglie di questa matrice Variando la concentrazione di agarosio o$engo maglie più o meno fi$e, da usare in funzione della dimensione del frammento (più è piccolo e più migra velocemente). I frammen. più grandi e pesan. migrano più lentamente.

8 Come si visualizzano i frammen.? La visualizzazione è garan.ta da sostanza intercalan:, come l'e.dio di bromuro, che sono fluorescen. se esposte ai raggi UV. Può essere aggiunto dire$amente nel gel (la velocità di migrazione si riduce del %), o alterna.vamente dopo l ele$roforesi. Quando è esposto ai raggi ultraviolet, infat, esso è in grado di eme$ere fluorescenza che si intensifica di quasi 20 volte se intercalato nel DNA. Il bromuro d'e.dio può essere un mutageno molto efficace e può indurre effet carcinogenici. Per tale mo:vo, necessita di molta a#enzione nell'uso. Esistono altri.pi di coloran.: colorazione con argento, blu cresile brillante, blu di me.lene (altamente tossico).