TECNICHE ELETTROFORETICHE. - Purificazione di molecole: elettroforesi preparativa. - Controllo della purezza di una molecola in un campione

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1 TECNICHE ELETTROFORETICHE Aree di applicazione: - Purificazione di molecole: elettroforesi preparativa - Controllo della purezza di una molecola in un campione - Determinazione quantitativa di una molecola - Determinazione del P.M. di una molecola - PROTEOMICA

2 Le tecniche elettroforetiche sono applicabili ad un ampia serie di sostanze: - Proteine - Acidi nucleici -Peptidi - Amminoacidi - Acidi e basi organiche -Farmaci -Pesticidi - Anioni e cationi inorganici N.B.: Nei campioni da sottoporre a elettroforesi non devono essere presenti sostanze insolubili o grassi in sospensione

3 Le tecniche elettroforetiche sono influenzate da una serie di fattori legati alla natura del campione e non: - carica del campione - forma del campione - dimensioni del campione - ph del mezzo (tampone) - forza ionica del mezzo - concentrazione del mezzo MOBILITA ELETTROFORETICA - tipo di supporto - elettroendosmosi

4 Principali gruppi chimici coinvolti nel fenomeno dell elettroendoosmosi: - gruppi carbossilici (carta,..) - gruppi solfato (agarosio, ) - gruppi silanolici (vetro,..) parete del capillare parete del capillare I gruppi silanolici del vetro possono assumere carica negativa attraendo così i cationi dell elettrolita. Si forma una sorta di doppio strato di cariche elettriche (regione di separazione di carica). Al momento in cui viene applicato un campo elettrico, i cationi dell elettrolita, presenti nella regione di separazione di carica, migrano verso il catodo trascinando con sé la soluzione elettrolita (flusso elettroendoosmotico).

5 LEGGE DI OHM La resistenza R dipende da: - supporto -tampone - temperatura V = I x R V = voltaggio (V, Volts) I = intensità (A, Ampere) R = resistenza (Ω, Ohms) Durante una corsa elettroforetica, il passaggio di corrente porta ad un aumento della temperatura W è la potenza generata nel mezzo di resistenza R dal passaggio della corrente I W = I 2 x R La maggior parte di questa potenza viene dissipata sotto forma di calore

6 EFFETTI DEL CALORE - Il calore aumenta la velocità di diffusione dei campioni e degli ioni del tampone - Il calore determina comparsa di correnti convettive che portano al mescolamento dei campioni - Il calore può danneggiare i campioni (denaturazione di proteine, perdita di attività di enzimi) - Il calore può far diminuire la viscosità del tampone con riduzione della resistenza Sono necessari alimentatori stabilizzati e sistemi di refrigerazione del gel durante la corsa

7 ELETTROFORESI E un metodo di separazione basato sulla diversa velocità di migrazione di molecole cariche sottoposte ad un campo elettrico. Il gradiente di potenziale (E) generato da una differenza di potenziale (V) applicata tra due elettrodi, posti ad una distanza d l uno dall altro, è espresso dalla relazione: V E = d La forza F applicata su una molecola con carica q in risposta al potenziale applicato risulta essere: F = E x q

8 La velocità v con cui la molecola si muove sarà data da: v = E x q f con f, coefficiente frizionale, che dipende da: - dimensioni della molecola - forma della molecola - viscosità del mezzo (tampone) usato - dimensione dei pori del supporto in cui migra la molecola Solitamente si preferisce parlare di mobilità elettroforetica (µ): µ= q f

9 ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMMIDE (PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis) Per l analisi di proteine si usano di solito concentrazioni che vanno dal: 8% per grosse proteine o anche frammenti cellulari (es. agglomerati di proteine di membrana) 20% per proteine più piccole (fino a 1600 Da) Spesso vengono utilizzati gel preparati con un gradiente di concentrazione di poliacrilammide (es. 9-16%). La reazione di polimerizzazione avviene secondo un meccanismo radicalico che richiede uno starter ed un catalizzatore. TEMED (tetrametilendiammina). S 2 O e - SO SO 2-4 radicale con un e- spaiato R + M RM (R ) + M RMM + M RMMM...

10 CH 2 CH C O NH 2 CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH + C O TEMED C O C O NH NH 2 NH 2 CH 2 NH C O CH 2 CH S 2 O 8 2- CH 2 CH CH 2 C O NH C O C O C O NH NH 2 NH 2 CH 2 NH C O CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH C O C O C O C O NH 2 NH 2 NH 2 NH CH 2 CH 2 NH NH C O C O CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH C O C O C O C O C O NH 2 La dimensione dei pori dipende da due parametri: T = (a + b) 100 V a: massa in grammi di acrilammide b: massa in grammi di metilenebisacrilamide V: il volume in ml NH 2 NH 2 % C = b T= concentrazione totale in % 100 a + b % C= reticolazione % NH 2 NH 2

11 - valutazione della purezza di un campione - determinazione della massa molecolare - seconda dimensione in 2-DE Detergente Anionico PROCEDURA GENERALE Il campione viene solubilizzato in tampone contenente SDS e mercaptoetanolo 100 C per 5 min La proteina è così denaturata e presenta carica negativa proporzionale alla sua massa (~ 1 SDS ogni 2 aa) Il campione viene applicato al gel Applicazione campo elettrico (Il campione migra nello stacking gel) Il campione migra nel separating gel, separandosi nelle sue componenti

12 I campioni sono sciolti in una soluzione contenente: Tampone Tris ph 6.8 SDS Glicerolo (per aumentare la densità) 2-mercaptoetanolo o DTT (per ridurre eventuali ponti disolfuro) Blu di bromofenolo (indicatore della corsa) Eventuali detergenti

13 Miscela standard di proteine con peso molecolare noto stacking gel separating gel Stacking gel tampone tris-glicina ph 6.8 : Gly bassa mobilità (PI 6.1) Separating gel tampone tris-glicina ph 8.8 : Gly alta mobilità

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15 ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE (2-DE) PRIMA DIMENSIONE (IEF) Le proteine si separano in funzione del loro punto isoelettrico SECONDA DIMENSIONE (SDS-PAGE) La seconda corsa elettroforetica separa le proteine (già separate e distribuite sulla strip in base al proprio PI) in funzione del loro PESO MOLECOLARE. 3 pi 10 kda

16 Isoelettrofocalizzazione (IEF) Sfrutta come parametro di separazione il diverso punto isoelettrico (pi) delle proteine La carica netta di una proteina dipende dal valore di ph del mezzo. Richiede l uso di gradienti di ph: -anfoline -immobiline

17 CH 2 N (CH 2 ) n N CH 2 (CH 2 ) n (CH2)n NR 2 COOH Dove R = H o n = 2 o 3 (CH 2 ) n COOH Diagramma della formazione di un gradiente di ph mediante anfoline in un campo elettrico.

18 Gel di poliacrilammide da copolimerizzazione di: - acrilammide derivatizzata con gruppi tamponanti acidi deboli in genere con due gruppi carbossilici (pk 1 e pk 2 ) basi deboli in genere ammino gruppi terziari (pk 1, pk 2, pk 3 e pk 4 ) - monomeri di acrilammide Poliacrilammide copolimerizzata con immobiline

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20 PROBLEMI : Presenza di componenti insolubuli Proteine di membrana Proteine nucleari Proteine poco abbondanti Proteine basiche Necessità di applicare una quantità di campione elevata Quantificazione del campione La preparazione del campione è il vero passaggio critico della 2-DE

21 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE E una fase fondamentale per la buona riuscita di un E-2D PREVEDE DI: - conoscere le caratteristiche del campione - evitare degradazioni nel campione - evitare precipitazioni nel campione - evitare contaminazioni del campione

22 REGOLE GENERALI - Usare soluzioni pure - Usare inibitori di proteasi - Usare nucleasi o ultracentrifugazione - Eliminare componenti lipidiche (es. precipitazione con TCA o acetone) - Non superare livelli massimi di concentrazione proteica

23 TIPOLOGIA DEL CAMPIONE TESSUTO animale vegetale COLTURE CELLULARI fase di lisi animali vegetali lieviti batteri fase di lisi FLUIDI BIOLOGICI sangue saliva urina ecc. ALTRO terreno alimenti (farine, latte, ecc.) ecc.

24 METODI DI LISI DEL CAMPIONE FISICI trattamento al calore congelamento e scongelamento lisi osmotica CHIMICI detergenti (anionici, cationici e neutri) solventi organici ENZIMATICI enzimi che rompono le pareti di batteri, lieviti e cell. vegetali MECCANICI ultrasuoni (sonicatori) dispersori meccanici (ultraturrax, frullatori) sferette di vetro (glass beads) mortaio (sabbia di quarzo, abrasivi) potter celle a pressione (pressa francese)

25 CARATTERISTICHE DEL TAMPONE DI LISI PER CAMPIONI DA SOTTOPORRE A 2D-E NECESSITA DI: SOLUBILIZZARE, DENATURARE, RIDURRE E RIMUOVERE LE COMPONENTI INSOLUBILI NON-PROTEICHE SOLUZIONE STANDARD PER 2-DE2 DENATURANTI: 8M Urea o 2M Thiourea & 7M Urea DETERGENTI: 4% CHAPS o 2% CHAPS & 2% Sulfobetaine 3-10 AGENTI RIDUCENTI: 100mM DTT o 2mM TBP (Tributyl phosphine) and/or 65mM DTT ANFOLITI (range di ph variabile): % (TAMPONE (DEBOLE FORZA IONICA): Tris HCl 10 mm)

26 AGENTI DENATURANTI (UREA E TIOUREA) - rompono legami a idrogeno e interazioni idrofobiche - non hanno effetto sulla carica intrinseca delle proteine - possono formare cianati carbamilazione dei gruppi amminici delle proteine (la carica netta delle proteine cambia) PRECAUZIONI - Evitare il riscaldamento delle soluzioni - Deionizzare le soluzioni - Usare reattivi purificati - Usare soluzioni fresche o conservate a -20 C

27 AGENTI RIDUCENTI (DTT, DTE, MERCAPTOETANOLO, TRIBUTILFOSFINA) - rompono i ponti disolfuro intra e intercatena - completano il processo di denaturazione delle proteine Il DTT è forse il più usato. DIFETTO: migra verso l anodo durante la IEF, lasciando scoperta la zona basica del gel.

28 AGENTI DETERGENTI (NEUTRI) (CHAPS, sulfobetaina, octilglucoside..) facilitano il processo di distruzione delle membrane solubilizzano i lipidi e le sostanze poco solubili in mezzo acquoso rompono le interazioni proteina / proteina PRECAUZIONI: Non superare concentrazioni limite: 4% CHAPS 2% sulfobetaina 60 mm octilglucoside

29 ANFOLITI Miscele complesse di acidi poliammino-policarbossilici sintetici. Esistono in vari intervalli di ph. La scelta dipende dal campione che si vuole analizzare. facilitano la solubilizzazione delle proteine funzionano come scavanger per i cianati facilitano la precipitazione degli acidi nucleici inibiscono le interazioni fra proteine del campione e le immobiline usate nel gel della prima dimensione

30 DOSAGGIO DELLE PROTEINE TOTALI DEL CAMPIONE Fase fondamentale per: buona riproducibilità buona visualizzazione dei risultati corretta analisi comparativa dei dati ottenuti da due esperimenti N.B. Le proteine dei campioni trattati per l E-2D sono difficili da quantificare a causa della presenza di discrete quantità di riducenti, detergenti, anfoliti e tiourea Metodi comunemente usati per il dosaggio delle proteine totali e loro interferenze: Bradford (Coomassie) detergenti, anfoliti BCA (ac. Bicinconinico) riducenti, anfoliti, tiourea Talvolta può essere necessario prevedere una precipitazione selettiva delle proteine!!