MATERIALE DIDATTICO. A supporto sono rese disponibili le slides delle lezioni

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1 MATERIALE DIDATTICO 1.Metodologie Biochimiche. Bonaccorsi, Contestabile, Di Salvo. Casa Editrice Ambrosiana. Ed Biochimica Applicata. Stoppini, Bellotti. EdiSES, Sono utilizzabili alcuni capitoli presenti nel Lehninger e nel Voet. A supporto sono rese disponibili le slides delle lezioni

2 Cellule o tessuto Omogenizzazione/rottura di membrane e pareti cellulari Estratto grezzo: proteine e molecole solubili e particelle insolubili PELLET CENTRIFUGAZIONE SUPERNATANTE Monitorare sempre presenza e concentrazione proteica in ogni passaggio mediante tecniche analitiche FRAZIONAMENTO DI PROTEINE (semplificare l estratto proteico separandolo in frazioni con miscele di proteine) Miscele proteine di PURIFICAZIONE DI PROTEINE Isolamento di una o più proteine dalla miscela complessa Proteine pure

3 Fluido biologico Trattamento con soluzione acida o idro-organica PURIFICAZIONE DI PROTEINE Isolamento di una o più proteine dalla miscela complessa Inibizione di proteasi endogene (inibitori o trattamento acido) CENTRIFUGAZIONE SUPERNATANTE FRAZIONAMENTO DI PROTEINE (semplificare l estratto proteico complesso separandolo in frazioni più semplici di proteine) PELLET contenente cellule, frammenti di membrana, proteine o aggregati proteici insolubili Contenente peptidi e proteine (secrete o provenienti dallo sfaldamento di cellule epiteliali o dall essudato plasmatico) Proteine pure Miscele di proteine Monitorare sempre presenza e concentrazione proteica in ogni passaggio mediante tecniche analitiche

4 FRAZIONAMENTO DI PROTEINE (semplificare l estratto proteico complesso separandolo in frazioni più semplici di proteine) ULTRAFILTRAZIONE PRECIPITAZIONE FRAZIONATA TECNICHE CROMATOGRAFICHE PREPARATIVE TECNICHE ELETTROFORETICHE PREPARATIVE

5 SEPARARE PROTEINE PRESENTI IN MISCELE COMPLESSE: FRAZIONAMENTO PER ULTRAFILTRAZIONE L ESTRATTO PROTEICO può essere FRAZIONATO in base alla dimensione delle proteine È possibile separare delle frazioni che contengono proteine con diverso peso molecolare utilizzando delle membrane filtranti (ne esistono di diverso taglio molecolare: da 3 KDa a 100 Kda). In questo modo semplifico la miscela proteica. Estratto proteico: miscela di proteine differenti con dimensioni diverse RIEMPIRE Filtro 30 KDa CENTRIFUGARE RECUPERARE RACCOGLIERE Proteine con peso molecolare < 30 Kda: attraversano il filtro e sono raccolte sul fondo della provetta Proteine con peso molecolare > 30 Kda: trattenute dal filtro e recuperate in un volume minore di soluzione (CONCENTRATE)

6 SEPARARE PROTEINE PRESENTI IN MISCELE COMPLESSE: PRECIPITAZIONE FRAZIONATA Sfrutta la diversa solubilità che le differenti proteine hanno in funzione di: ph, Forza ionica, concentrazione di Sali disciolti in soluzione Temperatura Polarità del solvente

7 PRECIPITAZIONE AL PUNTO ISOELETTRICO Si basa sulla minore solubilità delle molecole proteiche a valori di ph pari al loro punto isoelettrico. A valori di ph lontani dal pi le molecole di una proteina sono o tutte cariche positivamente o cariche negativamente e quindi la loro solubilità è mantenuta poiché tendono a respingersi. A valore di ph = pi una proteina possiede un numero uguale di cariche positive e negative (carica netta nulla), ogni molecola possiede sulla sua superficie zone cariche positivamente e zone con carica negativa, per cui si creano interazioni ioniche che sono rafforzate da interazioni di van der Waals: FORMAZIONE DI AGGREGATI INSOLUBILI ph > pi ph < pi ph = pi

8 Modificando il ph della miscela proteica si può ottenere di volta in volta un precipitato costituito da proteine differenti che possono essere separate tra loro e rispetto a quelle rimaste in soluzione. Metodo vantaggioso se si conoscono i pi delle proteine di interesse e se l obiettivo non è ottenere la proteina in conformazione nativa. SVANTAGGIO: la proteina precipitata spesso subisce denaturazione Tale metodica dovrebbe essere usata per precipitare (e quindi) rimuovere le proteine contaminanti. Può essere utilizzata con buoni risultati se la proteina di interesse possiede un pi molto diverso da quello della maggior parte delle proteine cellulari. Se non si conosce il pi della proteina di interesse è necessario determinarlo in un esperimento pilota su piccola scala.

9 PRECIPITAZIONE CON SALI SALTING IN: a basse concentrazioni saline aggiungendo un sale alla soluzione contenente il nostro estratto proteico, la solubilità aumenta perché gli ioni del sale (per es. NaCl, Solfato d ammonio) interagiscono con la superficie polare delle molecole di una proteina incrementandone la solvatazione. SALTING OUT: aumentando notevolmente la concentrazione di sale (anche di volte), gli ioni del sale richiamano il solvente per essere solvatati, sottraendolo quindi alle molecole di proteina. Le molecole di proteina non solvatate tendono ad aggregarsi formando dei complessi insolubili che precipitano.

10 Aree idrofobiche AGGIUNTA DI CONCENTRAZIONI ELEVATE DI SOLFATO D AMMONIO SO 4 2- NH M NH 4 1 Molecole di H 2 O organizzate in strutture ordinate (quasi cristalline) intorno ai residui idrofobici superficiali. Le molecole di H 2 O sono richiamate per solvatare gli ioni del sale, e si staccano dalla superficie della proteina. Si staccano più facilmente le molecole d acqua che schermano le aree idrofobiche. LE PROTEINE SI AGGREGANO

11 si usa SOLFATO di AMMONIO perchè: È molto solubile (3.9M) garantisce elevate forze ioniche I = 1/2 Σ c z 2 È disponibile ad elevato grado di purezza Non ha effetti dannosi sulla struttura delle proteine Precipitazione reversibile Poiché le diverse proteine hanno differente polarità e proprietà acido/base, che dipendono essenzialmente dalla loro sequenza, si può ottenere una precipitazione sequenziale di differenti proteine presenti in miscela modificando la concentrazione del solfato d ammonio 1. Si aggiunge il sale allo soluzione proteica in agitazione sino a raggiungere la saturazione desiderata 2. Si centrifuga il campione e si separa una frazione solubile e un precipitato

12 Le proteine precipitate sono rimosse per centrifugazione 2. Si ripete il processo con una concentrazione crescente di sale. 3. Si utilizza una tecnica analitica per verificare la localizzazione della proteina di interesse nel precipitato o nel supernatante Tecnica di separazione adatta ai passaggi preliminari del protocollo di purificazione (alta capacità: lavora con grossi volumi di campione) Consente di concentrare la proteina precipitata (sarà risolubilizzata in un volume minore di tampone) Allontanamento di Contaminanti con solubilità Bassa Risoluzione: non è possibile purificare una proteina utilizzando esclusivamente questa tecnica

13 PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI ORGANICI ETANOLO, METANOLO, BUTANOLO, ACETONE, ACETONITRILE, altri Sfrutta la differente solubilità delle proteine in miscele acqua/solventi organici Il solvente organico compete con la proteina per le molecole di H 2 O di solvatazione Favorisce le interazioni elettrostatiche proteinaproteina a discapito di quella proteina-acqua. Le proteine formano aggregati che precipitano _ La precipitazione di peptidi e piccole proteine _ richiede concentrazioni elevate di solvente La precipitazione di grandi proteine richiede concentrazioni minori di solvente RSCHIO: denaturazione proteica, soprattutto se si lavora ad alte concentrazioni di solvente e a temperatura non controllata. UTILE QUANDO SI VOGLIONO STUDIARE LE PROTEINE DI MEMBRANA CHE SONO SOLUBILI NEI SOLVENTI ORGANICI E QUINDI POSSONO ESSERE SEPARATE DA QUELLE INTRACELLULARI

14 Prima di procedere con ulteriori step di purificazione è necessario: Eliminare l eccesso di Sali e solventi DIALISI il campione è messo dentro un sacchetto da dialisi, che è immerso in un opportuna soluzione tampone. La dialisi è effettuata sotto agitazione a freddo (4 C) per tempi più o meno lunghi e devono essere fatti più cambi del tampone. Il sacchetto è fatto di polimeri (cellulosa) modificati, e può avere dei pori di dimensioni diverse (100 Da Da). Misurare la CONCENTRAZIONE PROTEICA TOTALE (può essere misurata già in fase iniziale quando si ottiene il supernatante dell ESTRATTO PROTEICO GREZZO, e può essere misurata al termine di ogni step, per valutare la resa in proteine. INIZIO DIALISI Tampone di dialisi FINE DIALISI Si basa sulle differenze di DIMENSIONE. Sono trattenute le proteine e rimosse molecole e ioni a basso peso molecolare che per osmosi diffondono nel recipiente dove è presente un tampone meno concentrato.