Dall omogenato... alla purificazione di proteine

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1 Dall omogenato... alla purificazione di proteine Per poter purificare una proteina bisogna disporre di: 1)Un metodo per poter seguire la proteina nei diversi passaggi di purificazione (saggio enzimatico, immunodosaggio..) 2) Un metodo che abbia una buona resa 3) Un metodo che non denaturi la proteina

2 I primi passaggi di purificazione sono rappresentati generalmente da tecniche di frazionamento che non forniscono un elevato grado di purificazione ma...sono rapide, economiche e servono ad eliminare altre molecole non proteiche Il frazionamento selettivo si ottiene in seguito alla precipitazione delle proteine che dipende Dal tipo e dalla distribuzione delle catene laterali dei residui amminoacidici esposti al solvente Dal tipo di solvente (polare /apolare) Dalla forza ionica del solvente Dal ph del solvente Dalla temperatura

3 I metodi di frazionamento possono essere: denaturanti o meno a secondo del principio chimico-fisico applicato...hanno un alta capacità (si processano grandi volumi)...ma bassa risoluzione (vengono concentrate proteine con caratteristiche fisiche simili)

4 Frazionamento mediante variazioni della solubilità Vantaggi Riduzione di volume Parziale purificazione Adatta a passaggi preliminari (alta capacità)

5 La solubilità delle proteine dipende: Interazioni polari con il solvente acquoso Interazioni ioniche con i sali Interazioni repulsive tra molecole di identica carica Una proteina e solubile in acqua fintanto che i residui carichi superficiali sono solvatati da molecole di acqua mentre i residui idrofobici sono mascherati dalle molecole d acqua adiacenti a queste regioni.

6 La struttura tridimensionale delle proteine è mantenuta da molte interazioni deboli Interazioni ioniche: i gruppi con carica negativa (-COO - ) possono interagire con gruppi carichi positivamente (- NH 3+ ) Legami a idrogeno Interazioni idrofobiche: gli amminoacidi con catene laterali non polari tendono a localizzarsi all interno della molecola dove si associano con altri residui idrofobici. Legami disolfuro

7 Esempi di interazioni tra amminoacidi all interno della struttura terziaria

8 Come si può variare la solubilità delle proteine precipitazione con sali precipitazione isoelettrica precipitazione con solventi organici: acetone, alcool precipitazione con polimeri organici precipitazione mediante denaturazione al calore

9 Effetto dei sali sulla solubilità delle proteine A basse concentrazioni saline la solubilità di una proteina aumenta (salting in) poichè gli ioni aggiunti schermano le cariche ioniche multiple della proteina indebolendo le interazioni tra proteine. Inoltre le molecole d acqua si organizzano in clatrati che formano una zona che scherma l interazione idrofobica tra domini idrofobici Domini idrofobici Domini idrofobici Domini idrofobici Il clatrato crea una zona che scherma le cariche dei domini idrofobici che così non possono interagire

10 Effetto dei sali sulla solubilità delle proteine ad alta concentrazione Considerando una soluzione acquosa contenente proteine e sali all aumentare della concentrazione di sali le molecole libere di H 2 O che possono solvatare gli ioni salini diminuiscono. Le prime molecole di H 2 O che si rendono disponibili in queste condizioni sono quelle che si trovano a contatto con i gruppi idrofobici vicini alla superficie delle proteine le altre molecole di H 2 O sono impegnate in interazioni elettrostatiche con i gruppi polari delle proteine e quindi sono piu difficilmente cedibili.

11 al crescere della concentrazione salina i gruppi idrofobici superficiali delle proteine vengono scoperti e infine le proteine precipitano per interazioni idrofobiche tra loro Schema di percipitazione in presenza di Ammonio solfato Precipitazione delle proteine meno solubili Frazione solubile Precipitazione della proteina d interesse Precipitazione delle proteine più solubili salting out [(NH 4 ) 2 SO 4 ] (M) Naturalmente più la proteina contiene tratti idrofobici superficiali e piu risultera insolubile a basse concentrazioni saline.

12 PRECIPITAZIONE CON SALI- salting out Sali caotropici come la guanidina tiocianato aumentano la solubilità delle proteine ma le denaturano

13 Precipitazione frazionata con ammonio solfato (NH 4 ) 2 SO 4 La concentrazione si esprime in % saturazione (soluzione satura: circa 4 M a T 0) Si può aggiungere sale solido oppure una soluzione satura Si procede per aggiunte successive al sovranatante La proteina precipitata è separata (per centrifugazione) Tecnica NON denaturante

14 Ammonium Sulfate - Percent Saturation - La tabella indica, per ogni percentuale di saturazione che si vuole raggiungere, quanti gr di solfato d ammonio si devono aggiungere ad un litro di soluzione contenente proteine da precipitare. La quantità di sale da aggiungere tiene conto dell aumento del volume Initiale

15 Come si effettua la precipitazione Si misura il volume Si calcola la quantità di sale necessaria a raggiungere il grado di saturazione desiderato Si centrifuga per recuperare la proteina e si sospende in un piccolo volume Si aggiunge il sale poco alla volta sotto agitazione Si lascia riposare il flocculato

16 Altri vantaggi dell ammonio solfato: è economico estremamente solubile in acqua a bassa temperatura (circa 4 M a T 0) non denatura le proteine. SOLUBILITA DI DIVERSE PROTEINE A DIFFERENTI CONCENTRAZIONI DI (NH 4 ) 2 SO 4

17 Precipitazione al pi Lo stato di ionizzazione degli amminoacidi dipende dal ph! pk 1 = 2,34 pk 2 = 9,6 Il Punto isoelettrico (pi) corrisponde al valore di ph a cui la carica netta dell amminoacido è pari a zero pi = pk 1 + pk 2 2 Il pi è la media dei valori dei pk dei gruppi ionizzabli.anche le proteine quindi hanno un proprio pi

18 Precipitazione al pi A valori di ph superiori al pi la proteina è deprotonata esibendo cariche negative che si respingono. La proteina è quindi solubile A valori di ph inferiori al pi la proteina è completamente protonata e quindi cariche dello stesso segno anche qui si respingono A valori di ph pari al pi della proteina, aumenta l interazione proteina proteina dovuta all interazione di carica portando alla formazione di aggregati proteici insolubili

19 Effetto del ph Al pi le proteine hanno la minima solubilità perché sono minime le forze elettrostatiche repulsive tra le molecole.

20 Modifica del ph Al pi gli enzimi hanno la minima solubilità perché sono minime le forze elettrostatiche repulsive tra le molecole. E importante verificare che gli enzimi non siano danneggiati dai ph estremi che vengono utilizzati punto isoelettrico

21 Precipitazione isoelettrica Si modifica il ph avvicinandolo al pi Variando il ph spesso cambia la forza ionica Alto rischio di denaturazione

22 Punto isoelettrico di alcune proteine Proteina pl Pepsina < 1,0 Ovoalbumina (pollo) 4,6 Albumina del siero (uomo) 4,9 Insulina (bovino) 5,4 Fibrinogeno (uomo) 5,8 Y-Globulina (uomo) 6,6 Mioglobina (cavallo) 7,0 Emoglobina (uomo) 7,1 Ribonucleasi A (bovino) 9,4 Citocromo c (cavallo) 10,6 Istone (bovino) 10,8 Lisozima (pollo) 11,0

23 PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI ORGANICI I solventi organici (etanolo, metanolo, acetone) sottraggono molecole d acqua ai gruppi carichi e polari sulla superficie delle proteine. Pertanto i solventi organici alterano il processo di solvatazione delle proteine andando a competere con le proteine per il legame con le molecole d acqua. I gruppi carichi delle proteine vengono quindi scoperti e le proteine si aggregano a causa di interazioni ioniche tra le molecole proteiche.

24 .di conseguenza le proteine presenti in una soluzione acquosa contenente solventi organici precipitano in ordine decrescente a seconda del numero di gruppi carichi presenti sulla loro superficie e in misura maggiore man mano che aumenta la concentrazione del solvente Dominio idrofobico Solvente organico Interazioni ( ) che determinano l aggregazione di molecole proteiche in un tampone contenete un solvente organico

25 Denaturazione di una proteina ad opera di un solvente organico Quando il solvente organico riesce ad entrare all interno della proteina distrugge le interazioni idrofobiche che la stabilizzano provocando denaturazione ed autoaggregazione della proteina. A temperature molto basse si riduce la flessibilità delle proteine ed è più difficile che il solvente organico penetri all interno della proteina

26 Frazionamento al calore La struttura tridimensionale delle proteine è mantenuta da molte interazioni deboli Interazioni ioniche: i gruppi con carica negativa (-COO - ) possono interagire con gruppi carichi positivamente (- NH 3+ ) Legami a idrogeno Interazioni idrofobiche: gli amminoacidi con catene laterali non polari tendono a localizzarsi all interno della molecola dove si associano con altri residui idrofobici. Legami disolfuro

27 Esempi di interazioni tra amminoacidi all interno della struttura terziaria

28 Frazionamento al calore Uno dei metodi per frazionare le proteine è di sottoporle a riscaldamento per denaturarle. ma proteine diverse hanno una diversa stabilità termica che dipende dal numero di interazioni tra i differenti residui Pertanto la differente resistenza delle proteine alle diverse temperature può essere un metodo da utilizzare per separare le proteine

29 Effetto della temperatura A T > 40 C, molte proteine tendono a denaturarsi e a precipitare in seguito all interazione idrofobica tra residui di amminoacidi, presenti nel core delle proteine, che vengono esposti L aumento di temperatura può essere impiegato per precipitare proteine termo-labili, recuperando proteine termostabili

30 Dopo il frazionamento mediante precipitazione delle proteine dobbiamo verificare la presenza della proteina oggetto della purificazione nella frazione solubile nel caso in cui la proteina da purificare sia un enzima. dobbiamo poterlo dosare attraverso un saggio di attività La quantità di un enzima presente in una particolare frazione non è espressa in moli o in unità di massa ma in unità enzimatiche (UE). UE= la quantità di enzima capace di convertire 1 µmole di substrato in prodotto in un minuto in condizioni di ph, forza ionica ottimali alla temperatura di 25 C.

31 Tabella di purificazione di un enzima Frazione Vol Concent r Protein a totale Attività Attività totale Attività Specifica Fattore di purificazione Resa (%) (ml) mg/ml (mg) U/ml (UE) U/mg A.S. frazione A.S iniziale. UE fraz UE iniziali Omogenato Frazionamento con sali Attività specifica = UE totali /mg di proteine totali

32 Le proteine sottoposte ad un primo passaggio di purificazione mediante differenti metodi di frazionamento possono dover sottostare a cambiamenti di tampone o dover essere concentrati Ciò può avvenire mediante DIALISI e ULTRAFILTRAZIONE

33 OBIETTIVO DELLA DIALISI E DELLA FILTRAZIONE La dialisi è un procedimento chimico-fisico con cui molecole di piccole dimensioni vengono separate da macromolecole mediante una membrana permeabile L ultrafiltrazione è un processo mediante il quale le molecole di differente dimensione vengono separate utilizzando una forza che spinge i soluti attraverso la membrana

34 Separazione con membrane Dialisi Membrana da dialisi Soluzione concentrata Tampone Esistono membrane a porosità diversa (MWCO, Molecular Weight Cut-Off) Solo le molecole di piccole dimensioni, inferiori al cut-off della membrana, diffondono attraverso la membrana da dialisi. All equilibrio la concentrazione delle molecole piccole è la stessa all interno e all esterno della membrana. Le macromolecole restano all interno della membrana.

35 Membrane da dialisi Il processo di dialisi è accellerato oltre che dalla continua rimozione della soluzione esterna anche dalla agitazione. Generalmente la dialisi si effettua in camera fredda Agitatore magnetico

36 Dialisi inversa: un metodo per concentrare le proteine Reverse dialysis: (A) a solution of macromolecules (solid circles) and solvent molecules (open circles) is placed in a dialysis bag that is packed in dry poliethylene glycol powder; (B) the solvent molecules leave the bag and enter the polyethylene glycol phase. Neither the polyethylene glycol nor the macromolecules can pass through the membrane and so the solution is concentrated.

37 Concentratore statico Diversi volumi; diversi MWCO (Molecular Weight Cut Off) Adsorbente igroscopico Pozzetti per i campioni Membrana campione Setto non permeabile Campione concentrato

38 Filtrazione Le particelle più piccole si muovono attraverso la membrana assieme al fluido sotto l azione di una forza (nella filtrazione, la gravità) Microfiltrazione µm Ultrafiltrazione Dalton

39 Filtrazione Typical apparatus for suction filtration. A and B are held together by a spring clamp; F is a fritted glass support on which the filter is placed.

40 Concentrare mediante filtrazione Molecular weight cut-off (MWCO) Da

41 Nell ultrafiltrazione la forza applicata per far passare il solvente e le piccole molecole attraverso la membrana possono essere: Pressione (in genere, azoto) Forza centrifuga

42 Ultrafiltrazione Apparato per filtrazione La soluzione contenente piccole molecole e macromolecole è forzata contro la membrane molecolare. Molecole più larghe delle dimensioni del cut-off non possono passare attraverso la membrana. Le molecole più piccole e il solvente passano attraverso. Una barrretta magnetica rotante è usata per prevenire l intasamento della membrana. In questo modo le macromolecole possono essere concentrate.

43 Celle a pressione Nella cella un gas esercita una pressione Il liquido è tenuto in agitazione I soluti che non passano la membrana si concentrano

44 Apparecchi per Ultrafiltrazione

45 Ultrafiltrazione In alternativa l ultrafiltrazione può avvenire mediante centrifugazione utilizzando tubi con due compartimenti separati dalla membrana Mantenendo costante il volume e aggiungendo tampone, il campione può essere concentrato e dializzato nello stesso tempo (Diafiltrazione)

46 La soluzione proteica viene forzata attraverso i filtri mediante centrifugazione Soluzione proteica Filtrato Soluzione proteica Filtrato

47 Concentratore Centricon Campione Campione concentrato

48 DIALISI e ULTRAFILTRAZIONE (UF): APPLICAZIONI Eliminazione di molecole a basso PM (desalting) Cambiamento del tampone Concentrazione Studi di interazioni con ligandi (binding) Recupero di DNA Rimozione di batteri (sterilizzazione) Funzioni terapeutiche (emodialisi)

49 Liofilizzazione Proteine possono essere portate a secco senza che venga persa la loro attività biologica 1. La soluzione proteica viene congelata in fiala o pallone che viene collegato alla camera di condensazione a -60 C e sotto vuoto spinto 2. Per la notevole differenza di temperatura tra la soluzione congelata e la camera di condensazione e trovandosi sotto vuoto il ghiaccio della soluzione sublima e ricondensa nella camera del liofilizzatore Disidratazione sotto vuoto spinto della soluzione proteica congelata, sublimazione del solvente