TECNICHE CENTRIFUGATIVE

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1 TECNICHE CENTRIFUGATIVE

2 Le tecniche di separazione mediante centrifugazione sfruttano il comportamento delle particelle all interno di un campo centrifugo applicato

3 Lo scopo di tali metodiche e quello di esercitare sulle particelle una forza maggiore rispetto a quella esercitata dal campo gravitazionale terrestre, in modo tale da aumentare la loro velocita di sedimentazione

4 Grazie a tali metodiche, le particelle che differiscono per densita, forma o dimensione possono essere separate tra di loro, poiche sedimentano a velocita diverse. Ogni velocità risulta direttamente proporzionale al campo centrifugo applicato

5 PRINCIPI DI BASE DELLA SEDIMENTAZIONE La velocita di sedimentazione dipende dal campo centrifugo (G) applicato, che e diretto radialmente verso l esterno; esso e funzione della velocita angolare del rotore (, in radianti/sec) e della distanza della particella dall asse di rotazione (r, in cm), in base all equazione: G= 2 r

6 Essendo una rivoluzione del rotore pari a 2 radianti, la velocita angolare del rotore, in radianti al secondo, puo facilmente essere espressa in termini di rivoluzioni al minuto (rpm), ovvero: = 2 rpm/60

7 Il campo centrifugo (G) espresso in rpm diventa: G= 2 r 4 2 (rpm) 2 r/3600 ed e generalmente espresso in multipli del campo gravitazionale terrestre, cioe come rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo ed il peso della stessa in presenza della sola forza di gravita

8 Quindi, G e definito in termini di campo centrifugo relativo (RCF) o, piu comunemente, come numero di g (dove g è il campo gravitazionale terrestre, pari a 980 cm s -2 ): RCF= G/980 RCF= (1, ) rpm 2 r

9 N.B. : La velocita di sedimentazione di una particella dipende non solo dal campo centrifugo applicato, ma anche dalla sua massa, densita e forma, oltre che dalla densità e viscosita del solvente in cui avviene la sedimentazione

10 Nel corso della sedimentazione, inoltre, la particella e sottoposta ad una forza netta verso l esterno (F), che e data dall espressione: F=4/3 r p 3 ( p - m ) 2 r 4/3 r p 3 =volume della sfera di raggio rp p =densita della particella m =densita del mezzo r= distanza della particella dal centro di rotazione

11 Tuttavia, le particelle generano attrito quando migrano attraverso la soluzione; se si assume che la particella sia sferica e che si muova con velocita nota, allora la forza d attrito che si oppone al moto della particella e data dalla legge di Stokes: ƒ0 = 6 rp ƒ 0 = coefficiente d attrito per una particella sferica = coefficiente di viscosita del mezzo = velocita di sedimentazione della particella

12 Una particella di volume e densita noti, in un mezzo a densita costante, sara percio accelerata in un campo centrifugo fino a quando la forza applicata sulla particella stessa sara uguale alla forza d attito, cioe quando: F = ƒ0 4/3 r p 3 ( p - m ) 2 r= 6 rp

13 In pratica, le due forze si eguagliano abbastanza rapidamente, con il risultato che la particella sedimenta a velocita costante; quindi, la velocita e data da: = dr/dt = 2/9 r p 2 ( p - m ) 2 r/

14 Integrando tale equazione, e possibile ricavare il tempo di sedimetazione di una particella sferica sottoposta ad un campo centrifugo, in funzione delle variabili implicate e della lunghezza del percorso compiuto dalla particella nella provetta da centrifuga: t = 9 /2 2 r p 2 ( p - m ) ln r b /r t t =tempo di sedimentazione in secondi r t =distanza radiale dall asse di rotazione al menisco del liquido r b = distanza radiale dall asse di rotazione al fondo della provetta

15 La velocita di sedimentazione puo anche essere espressa in termini di velocita di sedimentazione per unita di campo centrifugo applicato, comunemente detta coefficiente di sedimentazione (s). Se il mezzo ha una composizione definita, la velocita di sedimentazione e proporzionale a 2 r, quindi l equazione si semplifica in: =s 2 r s= / 2 r

16 Gli studi di velocita di sedimentazione possono essere eseguiti impiegando svariati sistemi soluto-solvente; il valore misurato del coefficiente di sedimentazione, influenzato dalla temperatura, dalla densita e dalla viscosita della soluzione, viene spesso corretto nel valore che si otterrebbe in un mezzo la cui viscosita e densita fossero pari a quelle dell acqua a 20ºC, espresso come coefficiente di sedimentazione standard (S 20,w )

17 N.B.:I coefficienti di sedimentazione della maggior parte delle strutture biologiche sono molto piccoli e, per comodita, viene presa come unita di misura il valore di secondi, che viene definito come unita di Svedberg (S)

18 CENTRIFUGHE E LORO UTILIZZO Le centrifughe possono essere classificate in quattro categorie principali: piccole centrifughe da banco; centrifughe refrigerate a grande capacita ; centrifughe refrigerate ad alta velocita ; ultracentrifughe

19 PICCOLE CENTRIFUGHE DA BANCO Sono le piu semplici e le meno costose Impiegate solitamente per raccogliere piccole quantita di materiale che sedimenta rapidamente Velocita max compresa tra rpm Operano generalmente a temperatura ambiente

20 CENTRIFUGHE REFRIGERATE A GRANDE CAPACITA Hanno una velocita max di 600 rpm Sono dotate di camere del rotore refrigerate Possono impiegare una varieta di rotori intercambiabili

21 CENTRIFUGHE REFRIGERATE AD ALTA VELOCITA Velocita max di rpm Rotori intercambiabili Impiegate soprattutto nella raccolta di microrganismi,frammenti cellulari e organuli cellulari

22 ULTRACENTRIFUGHE Preparative: Velocita max di rpm; Camera del rotore refrigerata, blindata e sottovuoto; Sofisticato sistema di controllo della temperatura Analitiche: Velocita max di rpm; Camera del rotore refrigerata, blindata e sottovuoto; Dotate di un sistema ottico per l osservazione del materiale

23 SISTEMA DI ULTRACENTRIFUGA ANALITICA CON SISTEMA OTTICO DI SCHLIEREN

24 PRINCIPALI TIPI DI ROTORI Rotori a bracci oscillanti; Rotori ad angolo fisso; Rotori per tubi ad alloggiamento verticale

25 ROTORE A BRACCI OSCILLANTI Possiede bracci che durante l accelerazione del rotore si portano in posizione orizzontale, in modo tale che la provetta sia perpendicolare all asse di rotazione e parallela al campo centrifugo applicato

26 ROTORI AD ANGOLO FISSO Le provette sono poste in cavita scavate nel corpo del rotore e formano un angolo fisso tra 14 e 40º rispetto alla verticale

27 ROTORI PER TUBI AD ALLOGGIAMENTO VERTICALE Rotore ad angolo fisso nullo, in cui le provette sono sempre allineate verticalmente al corpo del rotore

28 Metodi di separazione nell ultracentrifugazione preparativa

29 CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE Il materiale che dev essere diviso nelle sue componenti viene separato in un certo numero di frazioni per centrifugazioni successive, aumentando gradualmente il campo centrifugo applicato N.B. :Alla fine di ogni centrifugazione solo il pellet viene lavato, risospeso e ricentrifugato

30 La centrifugazione differenziale e la tecnica piu usata per l isolamento degli organuli cellulari da omogenati di tessuto

31 CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA Metodo che viene usato quando e richiesta una separazione quantitativa di tutti i componenti di una miscela di particelle

32 Separazione isopicnica su gradiente di densita Centrifugazione isopicnica: dipende unicamente dalla densita idrostatica della particella

33 SEPARAZIONE ISOPICNICA SENZA GRADIENTE PREFORMATO Il campione viene mescolato con il mezzo che costituisce il gradiente, anziche stratificarlo in un gradiente preformato

34 MATERIALI PER GRADIENTI DI USO COMUNE E LORO APPLICAZIONI