Centrifugazione. Alle sospensioni viene applicato un campo gravitazionale artificiale attraverso la rotazione ad alta velocità (campo centrifugo).
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1 Centrifugazione Alle sospensioni viene applicato un campo gravitazionale artificiale attraverso la rotazione ad alta velocità (campo centrifugo). Viene sfruttata la differenza di densità tra le particelle ed il mezzo in cui sono sospese
2 Campo centrifugo Il campo centrifugo (G) è dato da: G = ω r Dove ω èlavelocitàdirotazioneespressainradianti s -1 r èla distanza dall asse di rotazione. Per esprimere la velocità di rotazione in giri min -1 (RPM): RPM ω = π 60 Il campo centrifugo viene quindi definito come: G = 4 π ( RPM 3600 ) r
3 Campo centrifugo relativo In genere il campo centrifugo viene espresso come campo centrifugo relativo (RCF) come multiplo della costante gravitazionale (980 cm s - ): RCF = G g = 4 π ( RPM ) r Che diventa: RCF = ( RPM ) r
4 Dal momento che le analisi biochimiche sono condotte di solito su particelle disciolte o sospese in soluzione, la loro velocità di sedimentazione dipende non solo dal campo centrifugo applicato ma anche: 1. dalla massa della particella, una funzione del volume e della sua densità. dalla densità e viscosità del mezzo nella quale essa sta sedimentando 3. da quanto la sua forma differisce da quella sferica
5 Velocità di sedimentazione Forza d attrito F 0 = v f = per una particella sferica non idratata il coeff. d attrito è v6πη r p F = 4 π 3 r p 3 ( ρ p ρ m η è il coeff. di viscosità ) ω r Per F = F 0 il moto è rettilineo uniforme v r p = 4 3 r p 3 6πη π ( ρ ρ p m) ω r
6 Velocità di sedimentazione Velocità di sedimentazione della particella Raggio della particella Densità della particella Densità del mezzo v = Costante per una sfera 9 r p ( ρ p m η ρ Viscosità del mezzo ) ω r Campo gravitazionale
7 Velocità di sedimentazione Se una particella ha una densità uguale a quella del mezzo: ρ ρ p p ν = ρ = ρ m 0 m = 0 non vi è sedimentazione.
8 Coefficiente di sedimentazione v = r p ( ρ ρ ) p m ω r 9 η S
9 Coefficiente di sedimentazione 1 S (Svedberg) = 10-13
10 Il principio della centrifugazione Campo gravitazionale indotto con la centrifugazione Sopranatante Precipitato (pellet) Sospensione Separazione completata
11 Centrifughe Centrifuga da banco Ultracentrifuga
12 Centrifughe RPM g Da banco Micro max max. 000 Super ~ 5000 ~ Ultra ~ ~
13 Centrifuga analitica
14 All inizio le particelle sono distribuite uniformemente nel mezzo (A), alla fine (Z) sono sedimentate in funzione delle loro dimensioni e della loro densità. Centrifugazione differenziale A Z Campo centrifugo Solvente Particelle piccole Particelle medie Particelle grandi Tempo di centrifugazione
15 Centrifugazione zonale A Z Campo centrifugo Campione Gradiente di densità Particelle piccole Particelle medie Particelle grandi All inizio le particelle sono stratificate al di sopra del gradiente (A), alla fine (Z) sono sedimentate in funzione delle loro dimensioni, della loro densità e della densità del mezzo.
16 Centrifugazione zonale (con centrifuga apposita) 1. Il gradiente è caricato nel rotore.. il rotore è accelerato lentamente, il gradiente si riorienta 3. Il campione è pompato ad una estremità del rotare 4. Il campione sedimenta radialmente 5. Alla fine il rotore decelera lentamente, 6. Il gradiente si riorienta senza disturbare le bande di particelle 7. Le bande vengono estratte usando una pompa peristaltica.
17 Centrifugazione isopicnica A Z Campo centrifugo Particelle piccole Particelle medie che si vogliono separare Particelle grandi All inizio le particelle sono disperse nel mezzo (A) che ha densità uguale a quella delle particelle che si vogliono separare, alla fine (Z) le particelle galleggiano alla densità del mezzo uguale alla loro.
18 Centrifugazione isopicnica con A gradiente Z Campo centrifugo Particelle piccole Particelle medie Particelle grandi All inizio le particelle sono disperse nel mezzo (A), durante la centrifugazione si forma il gradiente, alla fine (Z) le particelle galleggiano alla densità del gradiente uguale alla loro.
19 Gradiente su rotore swing-out
20 Rotori I rotori ad angolo fisso hanno piccole differenze tra r max e r min Rotore ad angolo fisso Il tempo richiesto per la sedimentazione è minore per rotori ad angolo fisso I rotori ad angolo fisso sono più pesanti e necessitano di una maggiore energia per operare I rotori a bracci mobili (Swing out) sono da preferire per centrifugare cellule e particelle r max -r min Rotore swing-out Per sedimentare macromolecole e particelle fini si usano rotori ad angolo fisso I rotori a braccia mobili sono da preferire per la centrifugazione su gradiente. r max -r min
21 Rotori Rotore swing-out Rotore ad angolo Fisso Rotore zonale
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