Strategia generale per la purificazione: metodi di frazionamento.

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1 Strategia generale per la purificazione: metodi di frazionamento. - Il fatto che le proteine fossero sostanze chimiche ben definite non venne accettato per intero finché James Sumner nel 1926 cristallizzò la prima proteina: l ureasi del fagiolo. - Le proteine vengono purificate tramite procedimenti di frazionamento. In una serie di tappe indipendenti, le proprietà chimico-fisiche della proteina che ci interessa purificare vengono sfruttate per separarla progressivamente dalle altre sostanze e dalle altre proteine. - Le caratteristiche chimico-fisico utilizzate sono: a) la solubilità; b) la carica ionica; c) la massa molecolare d) le proprietà di assorbimento; e) l affinità di legame ad altre molecole.

2 Dosaggio delle proteine (misurazione della loro concentrazione). - per poter purificare una proteina (o qualsiasi sostanza) è necessario disporre di un metodo che ci possa rivelare quantitativamente la sua presenza; - questo metodo deve essere specifico, sensibile e semplice da attuare: a) Saggi di attività enzimatica. b) Saggi di attività biologica. c) Tecniche immunochimiche. - si deve anche disporre di un metodo per misurare la concentrazione totale delle proteine, al fine di calcolare il grado di purificazione e la resa.

3 Metodi per la determinazione della concentrazione proteica Biureto. In condizioni alcaline, Cu 2+ si lega agli agli azoti del legame peptidico. Questo complesso assorbe a 520 nm. Non va bene con tamponi ammonici, EDTA. Test poco sensibile (1 mg/ml)

4 Lowry. Combina il Biureto con la riduzione in condizioni alcaline del reagente di Folin (acidi misti di fosfomolibdotungstato). Gli ioni rame complessati alle proteine facilitano il processo di riduzione. Colorazione blu attorno ai nm, dovuta alla reazione del biureto e alla formazione del Folin ridotto. La riduzione del Folin avviene fondamentalmente in presenza delle tirosine e dei triptofani. La sensibilità del test dipende dalla composizione della proteina e molte sostanze possono interferire (es. Tris, HEPES, EDTA). Le curve standard sono lineari soltanto a basse concentrazioni proteiche ( µg/ml). Saggio prevede tempi di mescolamento precisi.

5 BCA. Reazione simile al Lowry. Il rame ridotto nella reazione del Biureto (condizioni alcaline) viene chelato da due molecole di acido bicinconinico, con produzione di colore violetto, 562 nm. Sensibilità simile al Lowry ( µg/ ml), la reazione continua a svilupparsi nel tempo. Catecolamine, triptofano, lipidi, carboidrati, cisteina, tirosina, H 2 O 2, acido urico, ferro interferiscono sul saggio.

6 Bradford. Colorazione in acido, Coomassie Brilliant Blue, spostamento da 465 a 595 nm. Forti complessi non covalenti tramite interazioni elettrostatiche con gruppi amminici e carbossilici e forze di van der Waals. Risposta poco lineare a diverse concentrazioni proteiche. - Metodo rapido, sensibile e accurato. Compatibile con urea e guanidinio. - Sensibilità 2-20 µg/ml

7 Assorbanza. Tener presente l assorbimento dovuto agli acidi nucleici: [PROTEINA] = 1.55 A A 260 A 280 0,1% = 0,5-3 (mg/ml) -1 cm -1 ε 280 = A 280 0,1% x PM = M -1 cm -1

8 SOLUBILITÀ DELLE PROTEINE La presenza di gruppi ionizzabili (acidi e basici) polari e idrofobici presenti sulla superficie di in una proteina determina la dipendenza della sua solubilità: 1) dalla concentrazione dei sali disciolti nel mezzo; 2) dalla polarità del solvente; 3) dal ph; 4) dalla temperatura. Proteine diverse hanno, in determinate condizioni, valori di solubilità profondamente diversi: alcune precipitano, altre restano in soluzione Questo effetto viene utilizzato per la purificazione delle proteine.

9 1. Effetti delle concentrazioni saline Solubilità di alcune proteine in soluzioni di solfato di ammonio (NH 4 ) 2 SO 4

10 Forza ionica = I I = 1 c i z C i = concentrazione molare della specie ionica i Z i = carica ionica L effetto di ioni diversi dipende dalle loro: a) dimensioni b) idratazione S/S = solubilità nella soluzione salina/solubilità in acqua pura della carbossi-emoglobina al suo punto isoelettrico

11 SALTING IN: La solubilità di una proteina a bassa forza ionica aumenta in genere con la concentrazione salina. SALTING OUT: Ad elevate forze ioniche, la solubilità di una proteina tende a diminuire per via della competizione con il sale aggiunto per le molecole di acqua di idratazione. Di fatto, l attività del solvente risulta ridotta. Le interazioni proteina-proteina diventano più forti delle interazioni proteina-solvente e la proteina precipita.

12 Non tutti gli ioni producono l effetto del SALTING OUT: Ioduro (I - ), perclorato (ClO 4- ), tiocianato (SCN - ), litio (Li + ), magnesio (Mg 2+ ), calcio (Ca 2+ ) e bario (Ba 2+ ) aumentano la solubilità delle proteine. Questi ioni però tendono anche a denaturare le proteine e vengono detti CAOTROPICI

13 2. Effetto dei solventi organici I solventi organici miscibili con l acqua, come l acetone e l etanolo, precipitano le proteine in quanto abbassano la costante dielettrica del solvente, riducendone il potere di dissolvere ioni (come le proteine). Questo fenomeno può essere sfruttato come metodo di frazionamento, però richiede temperature vicino allo zero, o inferiori, per evitare l effetto denaturante che i solventi organici hanno a temperature più alte. L abbassamento della costante dielettrica aumenta l effetto del SALTING OUT e quindi in alcuni casi può essere utile combinare le due tecniche di precipitazione. Alcuni solventi organici, come la N,N dimetilformamide (DMF) o il dimetilsulfossido (DMSO), per via del valore elevato della loro costante dielettrica, sono invece ottimi solventi delle proteine.

14 3. Effetto del ph Precipitazione isoelettrica Solubilità della β-lattoglobulina (pi = 5,2) in funzione della [NaCl] e del ph

15 Cristallizzazione a) b) c) d) e) f) Azurina Flavodossina Rubredossina Mioemeritrina Emoglobina Batteriofillina A

16 TECNICHE DI CENTRIFUGAZIONE Principi della sedimentazione Ø Se un recipiente contenente acqua e sabbia viene agitato e poi lasciato riposare la sabbia sedimenta rapidamente per effetto della forza di gravità (g = 9,81 m s -2 ) Ø Le macromolecole in soluzione non sedimentano in quanto i moti termici casuali (moti Browniani) le mantengono uniformemente distribuite nella soluzione Ø Soltanto quando le macromolecole vengono sottoposte ad un accelerazione enorme il loro comportamento diventa simile a quello dei granelli di sabbia in sospensione

17 Principi della sedimentazione 2 G = ω r Rotori a bracci oscillanti ω = rad s 1 2π rpm ω= 60 G = campo centrifugo ω = velocità angolare rpm = giri al minuto RCF = G/g = 1,118x10-5 (rpm)2r campo centrifugo relativo

18 F sed = F att = 4 3 v πr p3 (ρ p -ρ m )ω 2 r forza a cui è sottoposta una particella f quando viene centrifugata f = Coefficiente frizionale= 6πη r p ( η=coefficiente di viscosità del mezzo) per una particella sferica non idratata v f = non c è più particella si massima v = 4 3 sedimentazione πr p3 (ρ p -ρ m )ω 2 r equilibrio che si raggiunge [2πr p2 (ρ p -ρ m )ω 2 r] 9η velocità di velocemente, in cui accelerazione e la muove alla velocità

19 Ø La velocità di sedimentazione dipende dal quadrato del raggio, per cui dalla dimensione della particella più che dalla densità. Ø Le particelle si muovono più velocemente verso il fondo della provetta, dove il campo centrifugo è maggiore. Ø Per particelle non sferiche il rapporto d attrito è f/f 0, in cui f 0 è il coefficiente d attrito di una particella sferica non idratata

20 Se il rapporto frizionale (f/f 0 ) è molto maggiore di 1, la particella è altamente solvatata o ha una forma allungata Ø Le proteine globulari hanno un rapporto frizionale che può arrivare fino a valori di 1,5 Ø Il DNA ed il fibrinogeno raggiungono valori di f/f 0 molto più elevati Ø Dopo denaturazione, il rapporto frizionale di proteine globulari aumenta anche di due volte

21 Una particella può essere caratterizzata dalla sua velocità di sedimentazione: s = v ω 2 r Coefficiente di sedimentazione 1 Unità Svedberg = s s viene sempre corretto per il valore che avrebbe a 20 C in acqua pura (s 20,w )

22 Coefficienti di sedimentazione di alcune sostanze biologiche Nuclei: s

23 CENTRIFUGHE ED ULTRACENTRIFUGHE Centrifugazione preparativa (centrifughe ed ultracentrifughe) Ø Le Centrifughe non generano un campo centrifugo molto elevato e sono utilizzate per separare particelle che sedimentano rapidamente, come microrganismi, frammenti cellulari, organelli di grandi dimensioni e proteine precipitate con (NH 4 ) 2 SO 4 Ø Le Ultracentrifughe operano a velocità angolari molto elevate ( rpm) e generano un campo centrifugo anche pari a g. La camera del rotore è sotto vuoto, refrigerata e blindata. L ultracentrifugazione viene utilizzata per separare organelli cellulari e macromolecole.

24 Rotori ad alloggiamento verticale Rotori ad angolo fisso Alloggiamento verticale

25 Metodi di separazione nell ultracentrifugazione preparativa Centrifugazione differenziale Separazione in frazioni per centrifugate successive, aumentando gradualmente il campo centrifugo applicato

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28 Metodi di separazione nell ultracentrifugazione preparativa Centrifugazione in gradiente di densità. Separazione dei componenti di una miscela in bande discrete Ø Ultracentrifugazione zonale (separa principalmente in base alle dimensioni, forma e densità, densità e viscosità del mezzo). Separa principalmente in base alle massa Saccarosio Le particelle si spostano lungo il gradiente in bande discrete. Le bande non sono all equilibrio. La centrifugazione deve essere fermata prima che si formino i pellet. Applicazioni: separazione di enzimi, ibridi DNA-RNA, subunità ribosomiali, ormoni. Può essere adattata a operazioni preparative di grossi volumi, con rotori zonali.

29 Metodi di separazione nell ultracentrifugazione preparativa Centrifugazione in gradiente di densità Ø Ultracentrifugazione in gradiente di densità all equilibrio o isopicnica (separa in base alla densità delle macromolecole) Metodo all equilibrio. Lunghe applicazioni. CsCl o Cs 2 SO 4 Formazione del gradiente La densità della soluzione viene misurata con un rifrattometro Le proteine solubili, tutte con densità simile (1,3 g/ml) non si possono separare con questa tecnica. Gli organuli subcellulari possono essere separati facilmente: Golgi (ρ = 1,11 g/ml), mitocondri (ρ = 1,19 g/ml), perossisomi (ρ = 1,23 g/ml) in soluzione di saccarosio.

30 Gradiente di densità: nella centrifugazione zonale serve a migliorare la risoluzione ed evitare i moti convettivi. Nella centrifugazione isopicnica serve e formare bande di particelle alle loro densità di galleggiamento. Formazione dei gradienti: continui lineari e non lineari, e discontinui. Caricamento del campione: importanza del volume e della concentrazione della soluzione. Il volume dipende dalla sezione trasversale della provetta (500 µl per 1,5 cm, 1 ml per 2,5 cm) Concentrazioni troppo alte sovraccaricano il gradiente e si verifica l allargamento delle bande e perdita di risoluzione. Per proteine e acidi nucleici in gradienti di saccarosio, la concentrazione dovrebbe essere di 1 µg/ml-1 mg/ml. Il caricamento deve essere effettuato con particolare cautela per la centrifugazione zonale. Recupero dei campioni dai tubi: spiazzamento verso l alto, recupero dal fondo e dal lato.

31 Tipi di gradiente: Cloruro di cesio (d max =1,91 g/cm 3 ) è separazione di DNA, nucleoproteine, virus isolamento di plasmidi Saccarosio (d max =1,32 g/cm 3 ) è separazione di particelle subcellulari, proteine, virus BSA (d max =1,35 g/cm 3 ) è separazione di cellule intere Percoll (d max =1,35 g/cm 3 ) è separazione di cellule intere (silice colloidale) e particelle subcellulari Il materiale che forma il gradiente deve: - essere stabile in soluzione - essere inerte nei confronti del campione e del tubo da centrifuga - non interferire con le analisi spetrofotometriche successive - non variare la pressione osmotica, il ph, la forza ionica, viscosità

32 ULTRACENTRIFUGAZIONE ANALITICA Sistemi di rivelazione: - assorbimento della luce - sistema ottico di Schieren (rifrazione della luce)

33 Determinazione della massa molecolare relativa dalla velocità di sedimentazione V = sw 2 r sw 2 dt = dr/r lnr = sw 2 t lnr coeff. ang = sw 2 tempo RTs M r = D(1-νρ) Eq. di Svedberg D = coeff. di diffusione ν = volume specifico ρ = densità del solvente R = costante molare dei gas T = temperatura in kelvin

34 Dal gradiente di sedimentazione all equilibrio (più versatile e più accurato) L ultracentrifuga viene fatta funzionare finché non si raggiunge un equilibrio tra la sedimentazione e la diffusione del materiale in direzione opposta. A questo punto la distribuzione della concentrazione cresce esponenzialmente con il quadrato della distanza radiale. Questa distribuzione dipende dalla massa molecolare. La massa molecolare può essere calcolata in base al gradiente di concentrazione del soluto che si è venuto a creare. M r = 2RT ln(c 1 /c 2 ) ω 2 (1-νρ) (r 2 2 -r2 1 ) La sedimentazione all equilibrio può avere tempi molto lunghi (da vari giorni a molte settimane) a cui si è ovviato con celle analitiche poco profonde (1-3 mm)

35 Stima della purezza delle macromolecole (virus, DNA e proteine) - Analisi del fronte di sedimentazione - L omogeneità può essere presunta solo dalla mancanza di eterogeneità rilevabile - Le impurità di una preparazione compaiono come picchi addizionali o come asimmetrie del picco principale. - Questa tecnica non dà indicazioni per quanto riguarda le eterogeneità dovute a modificazioni post-traduttive, (es. cambiamento del pi ma non della dimensione e forma della molecola.

36 Analisi delle variazioni conformazionali (ssdna, dsdna, proteine allosteriche) - Misurazione della velocità di sedimentazione della molecola - Più la molecola è compatta, minore sarà il suo attrito col solvente. Analisi delle variazioni conformazionali: equilibrio dimero/tetramero, denaturazione delle protiene