Biocatalizzatori. Tecniche di immobilizzazione e applicazioni biotecnologiche di cellule ed enzimi
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- Aloisia Zanetti
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1 Biocatalizzatori Tecniche di immobilizzazione e applicazioni biotecnologiche di cellule ed enzimi
2 BIOCATALIZZATORI Catalizzatori biologici per ottenere un prodotto di interesse Cellule in coltura l organismo viene cresciuto nel terreno A le cellule vengono raccolte e risospese nel terreno B che contiene il substrato da trasformare condizioni di crescita e di biotrasformazione da ottimizzare separatamente Enzimi purificati si risolvono eventuali problemi legati alla permeabilità della membrana si evita la formazione di prodotti collaterali possibili problemi di stabilità
3 BIOCATALIZZATORI IMMOBILIZZATI VS SOLUBILI Separazione del prodotto Operazione in continuo Tempo di reazione Effetti di inibizione Rigenerazione Stabilità Biocatalizzatore solubile Può essere difficile Impossibile Lungo (bassa [E]) Difficili da controllare?? Biocatalizzatore immobilizzato Facile Di regola Breve (alta [E])? Può essere usato più volte Può aumentare con l immobilizzazione E necessario mantenere l attività catalitica nell immobilizzazione
4 BIOCATALIZZATORI IMMOBILIZZATI VS SOLUBILI
5 BIOCATALIZZATORI IMMOBILIZZATI Immobilizzazione senza supporto (carrier-free) Immobilizzazione su supporto (carrier) Principali gruppi reattivi sul biocatalizzatore che possono essere usati per l immobilizzazione con formazione di legami covalenti: NH 2 (N-terminale e catena laterale di Lys) COO - (C-terminale e catena laterale di Glu e Asp) SH (catena laterale di Cys)
6 Metodi di immobilizzazione carrier-free (self-immobilizzazione) Cristalli reticolati (CLEC) Aggregati reticolati (CLEA) Cross-linking con glutaraldeide
7 Metodi di immobilizzazione di biocatalizzatori
8 Formati dei supporti (carrier)
9 Tecniche di immobilizzazione Adsorbimento Preparazione semplice Tipo di legame debole Attività dell enzima intermedia Rigenerazione possibile Stabilità bassa Cross-linking Preparazione semplice Tipo di legame forte Attività dell enzima bassa Rigenerazione impossibile Stabilità alta Legame ionico Preparazione semplice Tipo di legame intermedio Attività dell enzima alta Rigenerazione possibile Stabilità intermedia Legame covalente Preparazione difficile Tipo di legame forte Attività dell enzima alta Rigenerazione rara Stabilità alta Intrappolamento Preparazione difficile Tipo di legame intermedio Attività dell enzima bassa Rigenerazione impossibile Stabilità alta
10 Supporti per immobilizzazione Le matrici organiche naturali o sintetiche usate per l immobilizzazione di cellule o enzimi devono essere stabili e non reattive. Le matrici devono essere attivate.
11 Attivazione di una matrice polisaccaridica con bromuro di cianogeno (CNBr) per immobilizzare gruppi NH 2 Immobilizzazione ph 8-10 Attivazione ph 12
12 Matrici derivatizzate e attivate per reagire con diversi gruppi sulle proteine (-NH 2, -COOH, -SH, aminoacidi aromatici ecc.) La presenza di un braccio spaziatore sulla matrice riduce problemi legati all ingombro sterico e all accessibilità del sito attivo dell enzima immobilizzato
13 Le carbodiimidi: cross-linker specifici per gruppi carbossilici/ amminici EDC 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride EDC reagisce con un gruppo carbossilico sulla molecola 1 formando un intermedio O-acylisourea. Questo intermedio può reagire con un gruppo amminico sulla molecola 2, formando un legame covalente tra le due molecole.
14 Multi-point attachment su Eupergit C Eupergit: sfere macroporose di co-polimeri derivati dell acrilammide, attivata con epossidi (reagiscono preferenzialmente con gruppi amminici)
15 Metodi di immobilizzazione: incapsulamento multi-strato
16 Bioreattori Supporti polimerici: particelle, membrane e nanofibre Packed-bed reactors (biocatalizzatore impaccato su colonna) Fluidized-bed reactors (biocatalizzatore mantenuto in movimento da un flusso continuo di substrato) Continuous flow stirred reactors (biocatalizzatore mescolato con il substrato a flusso continuo) Membrane reactors (biocatalizzatore separato da una membrana)
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20 Linalool Terpineol Geraniol
21 Applicazioni biotecnologiche di cellule immobilizzate per la produzione di etanolo Conversione del lattosio contenuto nel siero di latte (prodotto di scarto dell industria casearia)
22 Applicazioni biotecnologiche di cellule immobilizzate
23 Applicazione di enzimi nella degradazione dell amido. Proprietà ed alcune applicazioni dei prodotti di idrolisi dell amido
24 Applicazione di enzimi nella degradazione dell amido per la produzione di sciroppo ad alto contenuto di fruttosio Enzimi coinvolti nella degradazione dell amidoi
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26 Applicazione di enzimi nella degradazione dell amido per la produzione di sciroppo ad alto contenuto di fruttosio
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30 ENZIMI TERMOSTABILI TERMOZIMI Enzimi prodotti da organismi termofili (60-80 C) e ipertermofili (>80 C) Utilizzati in biologia molecolare nell industria dei detersivi e dell amido I termozimi sono molto simili agli enzimi mesofilici (mesozimi) Sequenze aminoacidiche simili (40-85% omologia) Strutture spesso sovrapponibili Meccanismo catalitico uguale Termozimi ricombinanti espressi in organismi mesofilici mantengono la loro termostabilità: sono intrinsecamente stabili
31 ENZIMI TERMOSTABILI TERMOZIMI Che cosa rende i termozimi stabili? sono più rigidi (minore suscettibilità alla degradazione proteolitica e ad agenti denaturanti) interazioni idrofobiche efficienza di impacchettamento (packing efficiency) ponti salini riduzione della tensione conformazionale (X Gly) riduzione dell entropia di unfolding (Gly Pro) stabilizzazione di loop e α-eliche legami idrogeno resistenza alla distruzione covalente (Cys, Asn, Gln, Asp)
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