Catalisi. Biotecnologie applicate alla progettazione e sviluppo di molecole biologicamente attive A.A Modulo di Biologia Strutturale

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1 Biotecnologie applicate alla progettazione e sviluppo di molecole biologicamente attive A.A Modulo di Biologia Strutturale Catalisi Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

2 Enzimi = catalizzatori = sostanza che accelera una reazione chimica senza essere essa stessa modificata in modo permanente nel processo (possibili modificazioni transitorie con rigenerazione finale dell enzima) accelerazione sia della reazione diretta che inversa aumento della velocità con cui si raggiunge l equilibrio, ma non alterazione delle concentrazioni finali di reagente/prodotto o della costante di equilibrio Enzimi = proteine e ribozimi (es: rrna) accelerazioni dell ordine di >10 9 vita organismi a T moderate enzimi primordiali poco efficienti funzionalità acquisita evolutivamente mediante mutazioni casuali (miliardi anni) organismi viventi più antichi termofili estremi

3 Esempio: Orotidina 5 -monofosfato decarbossilasi decarbossilazione fondamentale nella biosintesi delle purine reazione non catalizzata stima 78 milioni di anni per essere completata per metà reazione catalizzata < 1 s aumento velocità di volte

4 Proprietà generali degli enzimi Differenze rispetto ai normali catalizzatori chimici (1) velocità di reazione più elevate (2) condizioni di reazione più blande: T < 100 C, P = P atm, ph ~ neutro (una catalisi chimica efficiente invece può richiedere T e P elevate e ph estremi) (3) capacità di regolazione: - controllo allosterico - modificazione covalente degli enzimi - variazione della quantità di enzima sintetizzato (4) elevata specificità di reazione: nel riconoscimento dei substrati e prodotti (raramente si hanno prodotti collaterali)

5 Fattori che contribuiscono alla catalisi fattori di natura fisica struttura e proprietà fisiche dell enzima capacità di orientare opportunamente il ligando nel sito attivo fattori di natura chimica proprietà chimiche degli a.a. dell enzima e dei cofattori (se presenti) - stabilizzazione specie instabili - polarizzazione di legami - formazione addotti covalenti

6 Energia di attivazione di una reazione reazione chimica il substrato può subire riarrangiamenti - nella stereochimica - nella distribuzione di carica - nella struttura covalente se il substrato è un composto stabile, allora esiste una barriera di energia libera che si oppone alla trasformazione più è alta la barriera (barriera di attivazione) più è difficile che la conversione chimica avvenga e più lenta è la reazione si definisce stato di transizione: punto di massima energia libera nel percorso della reazione dal substrato a prodotto chimicamente corrisponde ad una specie che esiste per t~10-15 s (tempo di una singola vibrazione atomica) IMPORTANTE: è possibile che la stereochimica e la distribuzione di carica dello stato di transizione siano diverse da quelle del substrato e del prodotto

7 Energia di attivazione di una reazione Per catalizzare una reazione chimica l enzima diminuisce la barriera energetica di attivazione. Ciò può essere fatto in vari modi. - aumento dell energia libera (o stato fondamentale ) del reagente (o del prodotto, nel caso della reazione inversa) - diminuzione dell energia libera dello stato di transizione (cioè sua stabilizzazione) - presenza di più intermedi (molecole metastabili ad energia libera piuttosto alta) lungo la reazione tutte le barriere di attivazione sono inferiori a quella della reazione non catalizzata Poiché TS C2 è lo stato di transizione più alto nella reazione catalizzata, la velocità a cui i reagenti superano questa barriera determina la velocità complessiva

8 Destabilizzazione stato fondamentale legame del substrato in una conformazione meno stabile aumento dell energia libera del substrato verso quella dello stato di transizione aumento della velocità di reazione attraverso la destabilizzazione dello stato fondamentale Esempio: Orotidina 5 -monofosfato decarbossilasi - il gruppo carbossilato del substrato (carico -) non interagisce con gruppi carichi + nel sito attivo ma è situato in una tasca idrofobica ambiente sfavorevole per substrato legato aumento energia libera substrato legato facilitazione trasformazione nel prodotto neutro CO 2 (energia libera inferiore in un sito idrofobico rispetto al substrato)

9 Stabilizzazione stato di transizione siti attivi complementari agli stati di transizione, sia nella stereochimica sia nella configurazione di carica (o lo diventano durante la reazione) se lo stato di transizione viene legato più strettamente del substrato allora la barriera di attivazione viene ridotta e la reazione diventa più probabile la complementarità per lo stato di transizione spesso implica: -la presenza di gruppi carichi in posizioni del sito attivo in cui si svilupperanno cariche di segno opposto durante lo stato di transizione - la presenza di donatori/accettori di legami a H disposti in modo appropriato i siti attivi si adattano stericamente agli stati di transizione meglio di quanto essi facciano per i substrati l enzima può subire cambi conformazionali che migliorino la complementarità allo stato di transizione una volta che si lega il substrato

10 formazione complesso enzima-substrato Specificità di legame - interazioni di solito non covalenti contatti di van der Waals fra substrato e gruppi non polari dell enzima complementarità fra gruppi polari e carichi intorno alla molecola legata - costanti di dissociazione complesso enzima-substrato variabili 10-3 M M se l enzima trattiene troppo strettamente substrato o prodotto si riduce la sua efficienza come catalizzatore - aumento della probabilità di contatti produttivi fra molecole interagenti, se orientate favorevolmente a seguito del legame nel sito attivo - siti attivi evoluti per attrarre i loro substrati in modo che la ricerca del sito attivo non sia un processo casuale (campo elettrostatico) - l enzima può fornire gruppi chimici che partecipano alla catalisi (già opportunamente orientati prima che avvenga il legame col substrato o lo diventano dopo)

11 Specificità di legame Esempi:

12 Specificità di legame sottositi di specificità sottosito di reazione - durante la reazione catalitica parti del substrato possono subire cambiamenti in geometria, carica e legami covalenti - se un enzima presenta interazioni di legame con parti del substrato destinate a subire variazioni, queste interazioni dovranno essere rotte prima che il substrato cambi conformazione rallentamento dell enzima - mutazioni nel sottosito di specificità senza influenzare il sottosito di reazione possono consentire di operare la stessa reazione chimica su substrati molto diversi applicazione in medicina ed industria per progettare nuovi catalizzatori

13 Meccanismi di Catalisi Meccanismi di Catalisi i catalizzatori riducono l energia libera dello stato di transizione (ΔG ) stabilizzando lo stato di transizione della reazione catalizzata l efficienza degli enzimi è dovuta alla loro specificità nel legare i substrati combinata alla disposizione dei gruppi catalitici classificazione meccanismi di catalisi 1) Catalisi acido-base 2) Catalisi covalente 3) Catalisi favorita da ioni metallici 4) Effetti di prossimità e orientamento 5) Legame preferenziale dello stato di transizione

14 Prossimità e orientamento molecole di substrato intrinsecamente reattive mantenerle vicine nella corretta orientazione può essere sufficiente per facilitare la chimica appropriata di reazione ( fattore di prossimità o fattore di vicinanza ) Esempio: Aspartato transcarbamilasi condensazione di carbamil fosfato ed acido aspartato carbamil aspartato chimica dovuta alla reattività delle molecole non sono presenti catene laterali chimicamente reattive nelle vicinanze del punto in cui si forma il legame fra i substrati (regolazione allosterica)

15 Esempio: fosfoglicerato chinasi formazione di ATP e di 3-fosfoglicerato (3PG) (reazione 7 della glicolisi) reazione: chinasi perché la reazione inversa è il trasferimento di un gruppo fosforico a 3PG

16 Esempio: fosfoglicerato chinasi - struttura bilobata - sito di legame Mg 2+ -ADP su un dominio - sito di legame 1,3-BPG sull altro dominio (distanza ~10Å) - avvicinamento dei 2 domini creazione sito di legame per ione metallico reazione in ambiente privo di acqua (come nel caso dell esochinasi, ma strutture scorrelate)

17 Esclusione acqua ed accessibilità alcune reazioni chimiche non possono procedere rapidamente o non possono avvenire del tutto in presenza di acqua cambiamenti conformazionali che schermano il sito attivo dal contatto col solvente sito attivo in conformazione chiusa: - ciò che è legato è protetto dall acqua, ma i substrati non possono entrarvi ed i prodotti uscirne sito attivo in conformazione aperta: - l enzima non è un efficace catalizzatore l enzima a riposo è nello stato aperto il legame del substrato provoca il cambio conformazionale responsabile per la chiusura del sito attivo (può limitare la velocità di catalisi)

18 Esclusione acqua ed accessibilità i movimenti del coperchio sono guidati da moti termici caratteristici di tutte le molecole in soluzione il coperchio è tenuto chiuso solo da poche interazioni deboli col substrato e con il resto dell enzima. Quando tali interazioni si interrompono (accade periodicamente a T ordinarie) il coperchio si può aprire ed il prodotto uscire (non esiste un unico meccanismo comune a tutti gli enzimi che escludono H 2 O) movimento di apertura del coperchio non deve essere troppo veloce Es: GAPDH (gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi: reazione 6 della glicolisi) - trasferimento di ~1000 ioni idruro ogni secondo movimento 10Å ogni 10-3 s m / 10-3 s = km / 10-5 h ~ 10-6 km/h Enzimi e catalisi le transizioni conformazionali di un peptide in soluzione sono 10 4 volte più veloci