Ioni inorganici (Mg 2+, Zn 2+ ), o molecole organiche o metallorganiche (coenzimi)

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1 ENZIMI Tutti gli enzimi sono PROTEINE che funzionano da catalizzatori biologici nelle reazioni cellulari e lavorano in condizioni blande di temperatura e ph (sono in grado di aumentare la velocità delle reazioni biologiche anche di volte). Durante la reazione l enzima può essere temporaneamente modificato ma alla fine del processo ritorna nel suo stato originario, un enzima viene riciclato in modo da poter prendere parte alla stessa reazione numerose volte. Gli enzimi catalizzano le reazioni con una Specificità molto elevata: quando un enzima funziona correttamente non si formano mai prodotti secondari di reazione (che potrebbero essere potenzialmente tossici per la cellula)

2 Affinché un enzima funzioni correttamente è essenziale: 1) Che conservi la sua conformazione nativa: struttura proteica tridimensionale biologicamente attiva 2) La presenza di gruppi funzionali specifici che partecipano alla catalisi (quelli delle catene laterali dei suoi residui amminoacidici e/o quelli di cofattori) Ioni inorganici (Mg 2+, Zn 2+ ), o molecole organiche o metallorganiche (coenzimi) 3) Condizioni appropriate di temperatura e ph, che influenzano la stabilità della struttura proteica degli enzimi e quindi la loro attività catalitica. Ogni enzima possiede un intervallo ideale di valori di temperatura e ph all interno del quale è attivo.

3 Classificazione: In base al tipo di reazione che catalizzano OSSIDORIDUTTASI (deidrogenasi, ossigenasi, perossidasi, ossidasi, riduttasi) Reazioni di ossido-riduzione (trasferimento di elettroni, ioni H: o H ) TRANSFERASI (chinasi, transamminasi o amminotransferasi ) Reazioni di trasferimento di un gruppo, richiedono spesso la presenza di un coenzima (es.: le Chinasi >> trasferiscono un gruppo fosfato dall ATP su un substrato; le Transamminasi >> trasferiscono un gruppo amminico) IDROLASI Reazioni di idrolisi dei legami C=O, C-N, C-C, P-O-P.(l H 2 O agisce da accettore del gruppo eliminato) LIASI (sintasi, decarbossilasi ) Reazioni di lisi di un substrato che danno luogo alla formazione di un doppio legame. Reazione di eliminazione non idrolitica e non ossidativa. ISOMERASI Reazioni di cambiamenti strutturali all interno di una stessa molecola (isomerizzazioni) LIGASI (sintetasi) Reazioni di condensazione di 2 substrati che richiedono l energia chimica di un nucleotide trifosfato (ATP).

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5 L enzima partecipa alla reazione che catalizza senza modificare lo stato di equilibrio della reazione. L enzima accelera i tempi con cui reagenti e prodotti raggiungono l equilibrio. L enzima non modifica la variazione di energia libera tra reagenti e prodotti che si verifica durante la reazione Per es.: A B G A = Energia libera reagenti G B = Energia libera prodotti ΔG 0 = variazione di energia libera della reazione (rende conto della spontaneità della reazione) ΔG 0 < 0 = reazione esoergonica (spontanea) ΔG 0 > 0 = reazione endoergonica (non spontanea) A B Affinché avvenga la trasformazione dei reagenti in prodotti è necessario superare un dislivello energetico: ENERGIA DI ATTIVAZIONE (ΔG 0 ) (correlata alla velocità della reazione) ΔG 1 0 = E att della reazione diretta ΔG -1 0 = E att della reazione inversa

6 ENERGIA DI ATTIVAZIONE (ΔG 0 ) A B Quantità minima di energia che le molecole di reagente devono avere per superare gli ostacoli che si oppongono alla trasformazione in prodotti: 1) URTI MOLECOLARI 2) ORIENTAMENTO 3) FORZE REPULSIVE fra le molecole È l energia necessaria a raggiungere e superare lo stato di transizione della reazione. STATO DI TRANSIZIONE: è il momento più difficile della reazione, le molecole di reagente che urtano sono disposte correttamente per trasformarsi, subiscono distorsioni e sono tese perché contemporaneamente si devono rompere alcuni legami e formarsene degli altri. Solo le molecole con energia sufficiente possono superarlo e andare avanti nella reazione. È fornita dall En. Cinetica delle molecole di reagente in movimento, che è convertita in energia libera G: le molecole di reagente che hanno un En. Cin. all E att passano dallo stato iniziale allo STATO DI TRANSIZIONE

7 LA VELOCITÀ DELLA REAZIONE DIPENDE DALL ENERGIA DI ATTIVAZIONE La velocità di reazione è elevata se E att è bassa: vuol dire che un maggior numero di molecole hanno l en. Cinetica media all E att. La velocità di reazione è bassa se E att è alta: vuol dire che poche molecole hanno l en. Cinetica media all E att. L ENZIMA AGISCE ABBASSANDO L ENERGIA DI ATTIVAZIONE Modifica il meccanismo della reazione e crea un ambiente in cui i reagenti non incontrano ostacoli alla reazione Substrato (reagente) S + E ES E + P Complesso Enzima/substrato Prodotto ΔG 0 ES E + S ES EP S (in assenza di enzima) ΔG 0 EP Stato intermedio della reazione che si trova ad un minimo energetico ES E + P

8 L enzima lega il reagente (o i reagenti) >> SUBSTRATO/I. Abbassa l E att nella formazione di un complesso enzima/substrato (ES) Promuove direttamente l evento catalitico rilasciando il prodotto e ritornando inalterato nel suo stato originario S + E ES E + P L interazione reversibile fra enzima e substrato (o più substrati) è il passo fondamentale anche nelle reazioni enzimatiche più complesse. La formazione del complesso ES comporta il legame fra il SITO ATTIVO dell enzima e il substrato/i. Tasca della proteina in cui sporgono le catene laterali di alcuni residui amminoacidici che costituiscono il sito di legame per il substrato (responsabile della specificità) e di altri residui amminoacidici, o cofattori che costituiscono il sito catalitico (responsabile dell evento catalitico) La formazione di legami fra il sito attivo dell enzima e il substrato è un processo esoergonico: libera l energia necessaria ad abbassare la barriera di En att.

9 Quando si forma il complesso ES il substrato è bloccato nella corretta posizione (La specificità di legame fa si che il complesso ES si formi molto facilmente). Il substrato nel complesso ES subisce distorsioni in modo che gli atomi che devono reagire sono avvicinati. Le interazioni fra sito attivo di un enzima e substrato diventano ottimali solo quando è raggiunto lo stato di transizione del passaggio ES E + P stato di transizione S = substrato da scindere EP ΔG 0 ES E + S ES EP ΔG 0 EP ES E + P

10 Se il sito attivo fosse perfettamente complementare al substrato la reazione non procederebbe Nelson Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

11 La specificità del legame enzima/substrato può essere spiegata col modello chiave-serratura di Fisher Il sito attivo possiede dei punti di ancoraggio specifici per i gruppi funzionali del substrato Il potere catalitico di un enzima può essere spiegato col modello dell adattamento indotto di Koshland L enzima ha un sito che può alloggiare in modo specifico un substrato ma questo sito diventa complementare al substrato solo nello stato di transizione e solo attraverso un cambiamento conformazionale dell enzima stesso

12 Nel distorcere il substrato l enzima stesso cambia conformazione adattando perfettamente la forma del sito catalitico allo stato di transizione del substrato e presentando ad esso i suoi gruppi catalitici. esochinasi (è una trasferasi: trasferisce sul C-6 del glucosio un gruppo fosfato donato dall ATP e produce glucosio-6-fosfato)

13 velocità di reazione Effetto della temperatura sulla velocità di una reazione enzimatica Optimum di temperatura: è diverso per i diversi enzimi La velocità di reazione aumenta all aumentare della temperatura sino a raggiungere un valore massimo (Mantenendo costanti ph, [E] e [S]) A T superiori a quella ottimale viene alterato lo stato energetico del sistema e l enzima va incontro a modificazioni strutturali del sito attivo (rottura dei legami deboli, denaturazione)

14 Effetto del ph sulla velocità di una reazione enzimatica Da ricollegare al diverso stato di protonazione delle catene laterali di residui amminoacidici che costituiscono il sito catalitico e il sito di legame per il substrato.

15 velocità di reazione Cys-25 His-159 Massima attività Cys-25 His ph Cys-25 His-159 Massima attività: intervallo di ph compreso fra i pka di due residui amminoacidici del sito attivo (fra ph 4.2 e 8.2). In questo intervallo le catene laterali di entrambi i residui aminoacidici sono ionizzati. PAPAINA = enzima proteolitico, scinde i legami peptidici delle proteine. In quest enzima la cisteina è più acida e l istidina più basica di quanto non lo siano in altre condizioni FORMANO UNA COPPIA IONICA NEL SITO ATTIVO O=C l HN C H l CH 2 l H C N+ CH C N H H l CH 2 l S His-159 (pk R 8.2) O=C l HN C H Cys-25 (pk R 4.2)

16 1) Perché studiare la cinetica di una reazione enzimatica? Per determinare dei parametri specifici e caratterizzanti per un dato enzima che ci dicono: - Quanto un enzima è affine ad un dato substrato - Quanto l enzima è efficiente - Come posso controllare la velocità della reazione - Come posso regolare l attività catalitica dell enzima (inibendolo o attivandolo) 2) Cosa devo misurare per studiare la cinetica enzimatica? LA VELOCITA DI REAZIONE AL TEMPO ZERO IN FUNZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI SUBSTRATO (misurata come variazione della concentrazione di prodotto ottenuto nel tempo, o di substrato consumato nel tempo) 3) Come interpreto i dati ottenuti? Applico delle equazioni matematiche. Il modello matematico BASE per elaborare i dati di una cinetica enzimatica (per enzimi non allosterici) è quello proposto da L. Michaelis e M. Menten (1913)/Haldane e Briggs (1925)

17 CINETICA ENZIMATICA Gli esperimenti di cinetica enzimatica si basano sulla determinazione della velocità di reazione ad una determinata [S], misurata come variazioni della concentrazione del prodotto o del reagente in un dato intervallo di tempo. S P v = Δ[P] = _ Δ[S] Δt Δt Col procedere della reazione le curve cinetiche si appiattiscono: la velocità non subisce variazioni. S è consumato perché trasformato in P e la reazione tenderà a raggiungere l equilibrio. [S] [P] = aumenta nel tempo [S]= diminuisce nel tempo [P] tempo Se voglio avere una stima esatta di quale sia la velocità di reazione quando utilizzo una data concentrazione di substrato, devo misurare la velocità della reazione al momento iniziale (entro i primi sec), quando la quantità di prodotto formato è molto bassa e la concentrazione del substrato ha un valore preciso (quello iniziale stabilito dallo sperimentatore).

18 COME DETERMINO LA VELOCITA INIZIALE? Studio di una reazione enzimatica semplice (1 solo substrato e 1 solo stadio intermedio): 1) miscelo l enzima con il suo substrato, lavoro a temperatura e ph costanti, 2) mantengo inalterata la [E] e modifico la [S]: per ogni esperimento misuro come varia la velocità di reazione nel tempo. S P v = Δ[P] = _ Δ[S] Δt Δt Per es.: faccio 4 esperimenti con 4 diverse concentrazioni di substrato. La velocità di reazione varia al variare della concentrazione del substrato e dipende da una costante di velocità k che è specifica per ogni reazione. v = Δ[P] = _ Δ[S] Δt Δt v = k [S] k = -1/Δt (costante di velocità) 3) Determino il valore della velocità di reazione nello stadio iniziale (v 0 ) alle diverse [S].

19 VELOCITA INIZIALE (v 0 ) è calcolata come pendenza della tangente alla curva cinetica. Per ognuna delle curve cinetiche ottenute a diverse [S] viene calcolata la v 0 (4) v 0 (3) v 0 (2) v 0 (1) v 0 = k [S] È direttamente proporzionale alla concentrazione iniziale di reagente [S] usata per la reazione. Per gli enzimi che seguono la cinetica di Micaelis-Menten la dipendenza della v 0 dalla [S] è descritta da una curva iperbolica

20 Velocità iniziale v 0 (μm/min) ENZIMI CHE SEGUONO LA CINETICA DI MICHAELIS-MENTEN Inserendo i valori di v 0 ottenuti per le diverse [S] utilizzate in un grafico ottengo una curva iperbolica Alte [S] = la v 0 non varia molto al variare di [S], l enzima è quasi completamente saturato, viene raggiunta asintoticamente una velocità di reazione massima Basse [S] = la velocità di reazione v 0 dipende strettamente dalla [S], aumenta all aumentare della [S] Concentrazione substrato [S] (mm) Posso spiegare questo comportamento con un equazione che correla la v 0 alla [S], alla Vmax e ad una costante di affinità (Km)

21 ENZIMI CHE SEGUONO LA CINETICA DI MICHAELIS-MENTEN Mostrano una dipendenza della velocità iniziale (v 0 ) dalla concentrazione di substrato di tipo IPERBOLICO. Catalizzano una reazione enzimatica che nel caso più semplice prevede: 1 prima tappa veloce (ΔG minore e k maggiore) S + E k 1 k -1 ES 1 seconda tappa lenta (ΔG maggiore e k minore) che determina la velocità globale di reazione ES k 2 k -2 E + P k 1 = cost cinetica reazione di formazione del complesso ES k -1 = cost cinetica reazione di decomposizione del complesso ES in E + S k 2 = cost cinetica reazione di decomposizione del complesso ES in E + P

22 k 1 k 2 S + E ES E + P k -1 Formazione rapida e reversibile del complesso ES La velocità di formazione di ES dipende da [E] e da [S] e dalla cost. cin. k 1 S + E ES La velocità di demolizione di ES dipende da [ES] e dalle cost. cin. k -1 e k 2 ES S + E ES E + P Si assume che questo passaggio raggiunga velocemente lo STATO STAZIONARIO: in cui [ES] rimane costante, la velocità della sua formazione è uguale alla velocità della sua demolizione. Se questo è vero il rapporto fra le costanti cinetiche della dissociazione di ES e quella della sua formazione è uguale alla costante di dissociazione del complesso ES, chiamata Km (Costante di Micaelis-Menten) Km = k -1 + k 2 k -1 (k 2 << k -1 = trascurabile) Km = k 1 k 1 k -1 k 1

23 Km = k -1 k 1 La Km fornisce informazioni sull affinità che un enzima ha nei confronti del suo substrato ed è SPECIFICA per ogni diverso enzima nei confronti di un dato substrato. Più è grande, minore sarà l affinità dell enzima per il substrato (maggiore sarà la costante di dissociazione, k 1 > k -1 ) Più è piccola maggiore sarà l affinità (minore la costante di dissociazione, k 1 < k -1 ) Considerazioni valide per reazioni enzimatiche semplici a due tappe e in cui k 2 << k -1 non per tutti gli enzimi, molte reazioni enzimatiche sono a più tappe e la Km diventa una funzione più complessa che dipende da varie costanti cinetiche.

24 k 1 k 2 S + E ES E + P Passaggio lento: la v0 della k -1 reazione globale dipende da questo passaggio e quindi da [ES] v 0 = k 2 [ES] Da questa relazione se ne può dedurre un altra che consente di determinare la velocità massima di reazione. Infatti, esiste un momento della reazione in cui tutto l enzima che ho messo a reagire è complessato col substrato e quindi è in forma ES: ossia quando è raggiunta la VELOCITA MASSIMA di reazione (Vmax) Se [ES] = [E] TOT la v 0 = Vmax Possiamo raggiungere questa condizione quando utilizziamo concentrazioni saturanti di substrato. La velocità di reazione non dipende più dalla concentrazione di substrato, ma solo dalla concentrazione totale dell enzima: Vmax = k 2 [E] TOT Stabilite queste condizioni, il comportamento degli enzimi che seguono la cinetica di Micaelis-Menten è giustificato dalla seguente EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN

25 v 0 (μm/min) Equazione di Michaelis-Menten v 0 = Vmax [S] Km + [S] La velocità iniziale della reazione enzimatica dipende dalla [S] in modo iperbolico ed è correlata alla Vmax (= k 2 [E] tot ) e alla Km k 1 k 2 S + E ES E + P k -1 Km Costante di Michaelis Corrisponde alla [S] alla quale raggiungo la metà della Vmax. Ha le unità di misura di una concentrazione [S] (mm) v 0 = ½ Vmax = Vmax [S] [S] + Km 1 [S] = 2 [S] + Km Km + [S] = 2 [S] Km = [S]

26 v 0 (μm/min) 1 enzima 2 substrati simili A e B medesime condizioni di reazione Verso quale dei due l enzima è più affine? A A B ½ Vmax Km A Km B [S] mm

27 Costante catalitica o n di Turnover k 1 k 2 S + E ES E + P k -1 Vmax = k 2 [ES] = k 2 [E] TOT k Vmax 2 = [E] TOT k 2 per una reazione semplice ad uno stadio corrisponde alla k cat Indica il numero di eventi catalitici che avvengono nel sito attivo dell enzima nell unità di tempo (le sue unità di misura sono s -1 o min -1 ). Misura quanto velocemente un dato enzima può catalizzare una data reazione. E SPECIFICA per ogni enzima. Se lavoro con una miscela di reazione enzimatica in cui utilizzo una [S] saturante e voglio raddoppiare la velocità di reazione cosa devo modificare nel mio sistema? In che modo?

28 v 0 (μm/sec) [S] saturante = la v 0 raggiunge il suo valore massimo (Vmax), non può più variare in funzione della concentrazione di substrato perché tutto l enzima presente è saturato. Se voglio aumentare la Velocità di reazione devo aggiungere altro enzima alla miscela di reazione. Vmax = k 2 [E] tot per raddoppiare la velocità di reazione (Vmax) devo raddoppiare la concentrazione dell enzima Vmax B = k 2 [E] B [E] B = 2 [E] A Vmax A = k 2 [E] A LA Km RIMANE INVARIATA Km [S] mm

29 1/v 0 min/μm Determinazione sperimentale di Km e Vmax per una reazione enzimatica: GRAFICO DEI DOPPI RECIPROCI (Eq. di Lineweaver-Burk) (linearizzazione della curva iperbolica) >>>> 1 Km 1 1 = + Vmax [S] Vmax v 0 Trasformo i valori sperimentali di v 0 nei loro reciproci: 1/v 0 e i valori sperimentali di [S] nei corrispettivi reciproci 1/[S] La curva iperbolica del grafico di Micaelis- Menten diventa una retta che interseca gli assi in punti precisi consentendo di determinare con esattezza Vmax e Km, e quindi anche k cat 1/Vmax [S] = 10 mm [S] = 1,0 mm -1/Km 0,1 1/[S] mm -1 1,0

30 1/v 0 min/μm ½ Vmax v 0 (μm/min) 50 Vmax v 0 = Vmax [S] Km + [S] 2,0 (Km) [S] mm 1 Km 1 1 v = 0 Vmax [S] + Vmax Per calcolare la Vmax devo fare il reciproco del reciproco = 1 = 0,02 min/μm Vmax = 1 Vmax 0,02 min/ μm Vmax = 50 μm/min Per calcolare il valore della Km devo fare il reciproco negativo del reciproco = -1/Km = -0,5 mm -1 Km = - 1 = 2mM -0,5 mm -1 [S] = 1,0 mm 1/Vmax = 0,02 [S] = 10 mm -0,5 = -1/Km 0,1 1/[S] mm -1 1,0