Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA. Angela Chambery Lezione 17

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1 Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA Angela Chambery Lezione 17

2 Enzimi Concetti chiave: Gli enzimi si differenziano dai catalizzatori chimici di uso comune per velocità, condizioni, specificità e controllo della reazione. Le proprietà fisiche e chimiche uniche del sito attivo limitano l'attività degli enzimi a substrati e reazioni specifiche. Un enzima fornisce un percorso a bassa energia per convertire un substrato in prodotto, ma non influenza la variazione di energia libera complessiva della reazione.

3 Enzimi Il termine enzima (dal greco en, in e zyme, lievito ) fu coniato nel 1878 nel tentativo di sottolineare che nel lievito vi erano sostanze chimiche (fermenti) in grado di catalizzare le reazioni di fermentazione da cui si otteneva etanolo a partire dal glucosio (fermentazione alcolica). Solo nel 1926 fu isolata e cristallizata l ureasi di fagiolo che catalizza l idrolisi dell urea in NH3 e CO2 dimostrando che gli enzimi erano proteine.

4 Le velocità delle reazioni catalizzate dagli enzimi sono elevate Le velocità delle reazioni biochimiche catalizzate da enzimi sono normalmente da 10 6 a volte superiori rispetto a quelle delle corrispondenti trasformazioni chimiche non sottoposte a catalisi e almeno diversi ordini di grandezza superiori a quelle delle corrispondenti reazioni catalizzate per via chimica.

5 Le velocità delle reazioni catalizzate dagli enzimi sono elevate Le reazione biochimica che converte il perossido di idrogeno in acqua e ossigeno può essere velocizzata facendo avvenire la reazione su una superficie di platino ma può essere abbassata ancora di più facendola avvenire in presenza di catalasi.

6 Le velocità delle reazioni catalizzate dagli enzimi sono elevate Le reazioni catalizzate da enzimi avvengono in condizioni più moderate (T inferiore, ph vicino alla neutralità) Gli enzimi mostrano un grado di specificità per i loro substrati e prodotti straordinariamente superiore a quella dei catalizzatori chimici Le attività catalitiche degli enzimi possono essere regolate ovvero variano in risposta a sostanze diverse dai loro substrati (controllo allosterico, modificazione covalente, variazione di concentrazione)

7 Idrolisi di una ammide (legame peptidico) Il rapporto tra i minuti che occorrono per rompere i legami peptidici in presenza di acidi forti ( min) e in presenza di enzimi proteolitici è pari a Catalizzatore ph Tempo Temperatura Legami rotti Nessuno ph 7,0 Infinito Ambiente Nessuno H + /OH - < 1,0 > 13, ore 110 C Tutti Enzima proteolitico ph 7,0 10 min 37 C Alcuni

8 Gli enzimi sono classificati in base al tipo di reazione che catalizzano

9 Classificazione degli enzimi Gli enzimi sono generalmente denominati aggiungendo il suffisso asi al nome del substrato dell enzima o a un espressione che ne descrive l azione catalitica. CLASSI ESEMPI 1. OSSIDOREDUTTASI 1. LATTICO DEIDROGENASI 2.TRANSFERASI 2. GLUCOCINASI/ESOCINASI 3. IDROLASI 3. PROTEASI, RIBONUCLEASI 4. LIASI 4. ALDOLASI 5. ISOMERASI 5. TRIOSO- FOSFATO ISOMERASI 6. LIGASI 6. CARBOSSILASI Nomenclatura IUBMB: EC (EC: Enzyme Commission) Primo numero = Classe Secondo numero = sottoclasse (tipo di substrato) Terzo numero = tipo di accettore (es. NAD + ) Quarto numero = numero di serie dell enzima (ordine di scoperta)

10 Vantaggi della struttura quaternaria: la lattato deidrogenasi La lattato deidrogenasi è un tetramero cioè un oligomero formato da quattro protomeri che può costruirsi con due tipi di subunità: H (Heart) ed M (Muscle) per dare cinque forme tetrameriche H4, H3M, H2M2, HM3, M4. Tale enzima catalizza l interconversione tra lattato e piruvato: H H H H H H H H H M M M M M H M M M M M Nel tessuto muscolare predomina l isoenzima M4 che, avendo maggiore affinità per il piruvato, catalizza di preferenza la reazione nella direzione piruvato lattato. Nel cuore predomina l isoenzima H4, con affinità maggiore per il lattato e catalizza la reazione nella direzione lattato piruvato.

11 Sito attivo e sito catalitico La regione di un enzima a cui si lega il substrato (e i cofattori se esistono) è definita sito attivo per la catalisi enzimatica. Nel sito attivo possiamo poi distinguere il sito catalitico, costituito dai residui amminoacidici che partecipano direttamente alla formazione e alla rottura dei legami interessati nella catalisi e il sito di legame, ovvero la regione dove si lega il substrato. 1. Il sito attivo è costituito da una tasca (o fenditura) tridimensionale 2. Il sito attivo occupa una parte relativamente piccola del volume totale di un enzima 3. I siti attivi sono dei microambienti unici 4. I substrati si legano all enzima mediante un certo numero di interazioni deboli 5. La specificità del legame dipende dalla disposizione degli atomi nel sito attivo

12 Gli enzimi agiscono su substrati specifici Un sito di legame per un substrato è costituito da una fessura sulla superficie dell enzima la cui forma è complementare al substrato (complementarietà geometrica). Inoltre, gli amminoacidi del sito di legame sono disposti in modo da attirare specificamente il substrato (complementarietà elettronica).

13 Gli enzimi agiscono su substrati specifici La complementarietà tra enzima e substrato costituisce il fondamento del modello a chiave e serratura proposto da Emil Fischer nel 1894.

14 Gli enzimi agiscono su substrati specifici Il modello chiave e serratura è stato ad oggi sostituito dal un modello più realistico dell adattamento indotto in cui i siti di legame al substrato degli enzimi, sebbene in larga misura preformati, vanno incontro a modificazione conformazionale quando legano il substrato.

15 Cambio conformazionale nella esochinasi In assenza di glucosio e ATP la regione del sito attivo è accessibile ad H 2 O e molecole idrofile. In presenza dei substrati il sito attivo subisce una modificazione conformazionale che comporta la chiusura intorno al substrato impedendo l accesso all H 2 O. Al termine della reazione l enzima torna alla configurazione sterica di partenza. Dominio B Dominio A

16 Cambio conformazionale nella esochinasi

17 Alcuni enzimi catalizzano reazioni altamente stereospecifiche Le interazioni enzima-substrato sono inoltre stereospecifiche in virtù della chiralità intrinseca delle proteine costituite esclusivamente da L-amminoacidi. Non è possibile infilare la mano destra in un guanto sinistro.

18 Alcuni enzimi sono più permissivi Alcuni enzimi sono più permissivi sul tipo di substrato che possono accettare e sul tipo di reazione che possono catalizzare. La chimotripsina oltre a catalizzare l idrolisi dei legami peptidici idrolizza anche legami estere.

19 Diagrammi dello stato di transizione in assenza di enzimi Il punto ad energia libera più elevata è definito stato di transizione. AG ovvero la differenza tra l energia libera dello stato di transizione e quella dei reagenti è detta energia libera di attivazione. La velocità di reazione è inversamente proporzionale a AG.

20 Diagrammi dello stato di transizione in presenza di enzimi Gli enzimi agiscono generando un nuovo percorso per la reazione contraddistinta da uno stato di transizione la cui AG è inferiore a quella della reazione catalizzata.

21 Diagrammi dello stato di transizione a confronto

22 La cinetica delle reazioni Concetti chiave: Le semplici equazioni di velocità descrivono il progredire delle reazioni di primo e di secondo ordine. L'equazione di Michaelis-Menten mette in relazione la velocità iniziale di una reazione con la velocità massima e con la costante di Michaelis per un particolare enzima e un dato substrato. L'efficienza catalitica complessiva di un enzima è espressa come kcat/k M. Il grafico di Lineweaver-Burk può essere utilizzato per presentare i dati cinetici e per calcolare i valori di K M e Vmax.

23 Cinetica enzimatica Lo studio delle velocità delle reazioni catalizzate da enzimi è detta cinetica enzimatica. Le reazioni chimiche possono essere unimolecolari, bimolecolari e pseudomolecolari. L ordine di reazione indica il numero di molecole che partecipano ad una reazione elementare. A T costante, la velocità di una reazione è proporzionale alla frequenza con cui le molecole dei reagenti entrano in contatto. Reazione unimolecolare di primo ordine A P V=-d[A]/dt= d[p]/dt La velocità della reazione è direttamente correlata alla concentrazione di A da una costante di proporzionalità detta costante di velocità che si misura in s -1 V=k[A]

24 Cinetica enzimatica Un esempio di reazione unimolecolare di 1 ordine è il decadimento radioattivo. Isotopo Tempo di dimezzamento Emissioni Tritio 12,35 anni β C anni β P32 13,3 giorni β S35 87,40 giorni β I giorni γ 1 1/2 1/4 1/8 1/ t 1/2

25 Cinetica enzimatica Reazione bimolecolare di secondo ordine 2A P oppure A+B P La velocità della reazione è correlata alla concentrazione dei reagenti da una costante di velocità che si misura in M -1 s -1 V=k[A] 2 oppure V=k[A][B] Se B è presente in largo eccesso rispetto ad A oppure A è presente a basse concentrazioni la velocità della reazione non dipenderà dalla [B] (reazione di pseudo primo ordine). Reazioni di ordine zero La velocità della reazione non dipende dalla concentrazione dei reagenti.

26 Cinetica enzimatica Per una reazione enzimatica in cui si ha la conversione di un substrato S in prodotto P, l equazione stechiometrica è la seguente: S P Il meccanismo per una reazione catalizzata da un enzima può essere riassunto come: E+S k1 k-1 k2 ES P Si assume che la conversione di prodotto in substrato sia trascurabile. A tal fine, si definisce V0 (velocità iniziale) la velocità del prodotto in funzione del tempo quando il valore di [P] è molto basso, ovvero quando la reazione P ES è trascurabile.

27 Cinetica enzimatica Sulla base di questa reazione Michaelis e Menten proposero nel 1913 un modello per spiegare le caratteristiche cinetiche degli enzimi. E+S k1 k-1 k2 ES P Sperimentalmente si osserva che il grafico che descrive la variazione della velocità di reazione in funzione della [S] ha un andamento iperbolico che può essere descritto dall equazione di Michaelis-Menten: Cinetica di ordine 0 V non dipende dalla [S] V0= V max [S] K M +[S] Cinetica di 1 Ordine V dipende dalla [S]

28 Cinetica enzimatica E+S k1 k-1 k2 ES P Le velocità di formazione e dissociazione di ES sono date da: Velocità di formazione di ES= k1[e][s] Velocità di dissociazione di ES= (k-1+k2)[es] Gli enzimi sono capaci di reagire con il substrato in maniera molto efficiente e presto si raggiunge uno stato stazionario in cui le concentrazioni degli intermedi (i.e. ES) rimangono costanti e che si raggiunge quando la velocità di formazione e di dissociazione di ES si equivalgono. Da cui si ottiene: k1[e][s]= (k-1+k2)[es] [E][S]/[ES]=(k-1+k2)/k1

29 Cinetica enzimatica Allo stato stazionario [ES forma] = [ES dissocia]

30 Cinetica enzimatica [E][S]/[ES]=(k-1+k2)/k1 L equazione può essere semplificata definendo una nuova costante (Costante di Michaelis), indipendente dalle [E] e [S] con unità di misura di una concentrazione (moli/l): K M =(k-1+k2)/k1 Sostituendo K M nell equazione e riordinando per [ES] si ottiene: [ES]= [E][S]/K M La [S]>>[E]. La concentrazione dell enzima è invece uguale alla concentrazione totale dell enzima [E]T meno la concentrazione del complesso ES: [E]= [E] T -[ES] Sostituendo nell equazione precedente si ottiene: [ES]= ([E] T -[ES])[S]/K M

31 Cinetica enzimatica Risolvendo per ES si ottiene: [ES]= ([E] T -[ES])[S]/K M K M [ES]= [E] T [S]-[ES][S] [E] T [S]= [ES](K M +[S]) oppure [ES]= [E] T [S] K M +[S] Nelle fasi iniziali della reazione è presente una quantità così piccola di P che la reazione inversa P ES è trascurabile per cui la velocità iniziale di formazione del prodotto dipende solo dalla velocità di dissociazione del complesso ES V=k2[ES] Se la concentrazione di substrato è così alta che l enzima è completamente saturato dal substrato ([ES]=[E]T) la reazione procede alla massima velocità, Vmax con una cinetica di ordine zero rispetto al substrato Vmax=k2[E] T Da cui si ottiene: V=k2 [E] T [S] K M +[S] V= Vmax[S] K M +[S]

32 Cinetica enzimatica Quando [S]=K M allora V=Vmax/2 V= Vmax[S] K M +[S]

33 Grafico di Lineweaver-Burk dei doppi reciproci 1 V K M 1 = x + Vmax [S] 1 Vmax L equazione ottenuta facendo i doppi reciproci dell equazione di Michaelis-Menten corrisponde a quella di una retta y=mx+b dove La pendenza m=k M /Vmax L intercetta sull asse x è -1/K M L intercetta sull asse y è 1/Vmax

34 Significato di K M e Vmax La K M (espressa con le unità di misura di una concentrazione) è la concentrazione di S alla quale la velocità della reazione è pari alla metà della velocità massima. Viene spesso utilizzata come una misura dell affinità dell enzima per il suo substrato in quanto quando k-1>>k2, allora K M =k-1/k1 ovvero equivale alla costante di equilibrio per la dissociazione del complesso ES. Maggiore è K M minore è l affinità dell enzima per il suo substrato e viceversa. Ad esempio l esochinasi (K M =0,1x10-3 ) è più affine ma meno specifica nel catalizzare la fosforilazione del glucosio rispetto alla glucochinasi (K M =10x10-3 ) che è tuttavia più specifica per il glucosio. La Vmax esprime il numero di turnover degli enzimi ovvero il numero di molecole di substrato convertite in prodotto dall enzima nell unità di tempo quando l enzima è totalmente saturato dal substrato. Il numero di turnover esprime l efficienza della catalisi enzimatica e dipende dalla costante di velocità k2 (anche detta kcat) Kcat=Vmax/[E] T

35 I parametri della cinetica enzimatica Anche la costante Kcat/K M è una misura dell efficienza catalitica perché tiene conto sia della velocità di catalisi con un particolare substrato (kcat) sia della forza di interazione tra enzima e substrato (K M ). Comparando i valori di kcat/k M si può comparare la preferenza di un enzima per un substrato rispetto ad altri. Ad esempio dalla tabella si nota che la chimotripsina idrolizza di preferenza i legami peptidici vicini a residui aromatici e idrofobici ingombranti.

36 L'inibizione enzimatica Concetti chiave: Gli inibitori enzimatici interagiscono reversibilmente o irreversibilmente con un enzima alterandone i valori di K M e/o di Vmax L inibizione reversibile può essere competitiva, non competitiva o incompetitiva Un inibitore competitivo si lega al sito attivo dell'enzima e fa aumentare il valore apparente di K M della reazione. Un inibitore enzimatico incompetitivo influenza l'attività catalitica diminuendo i valori apparenti sia di K M sia di Vmax. Un inibitore enzimatico non competitivo influenza l'attività catalitica diminuendo il valore apparente di Vmax e lasciando inlterato quello di K M.

37 Inibizione enzimatica competitiva

38 Inibizione enzimatica competitiva Un inibitore competitivo si lega al sito attivo dell'enzima e fa aumentare il valore apparente di K M della reazione. 1/V max - 1/K M

39 Inibizione enzimatica incompetitiva

40 Inibizione enzimatica incompetitiva Un inibitore enzimatico incompetitivo influenza l'attività catalitica diminuendo i valori apparenti sia di K M sia di Vmax. 1/V max - 1/K M

41 Inibizione enzimatica non competitiva

42 Inibizione enzimatica non competitiva Nell inibizione non competitiva diminuisce il valore apparente di Vmax mentre rimane invariato quello di K M. 1/V max - 1/K M