1. Ossidoreduttasi 2. Transferasi 3. Idrolasi 4. Liasi 5. Isomerasi 6. Ligasi

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1 1. Ossidoreduttasi 2. Transferasi 3. Idrolasi 4. Liasi 5. Isomerasi 6. Ligasi ATP + glucosio glucochinasi ADP + glucosio-6-p E.C glucochinasi E.C esochinasi

2 Energia libera,g S k 1 k 1 = 10-4 K eq= [P] = k1 = P 10-4 k [S] k = k = 100 ΔG = G p G r ΔG = -RTlnK eq Stato di transizione Stato basale Stato basale k = A e - /RT Coordinata di reazione

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4 Stato di transizione Energia libera, G non cat Coordinata di reazione S + E ES EP E + P

5 Il sito attivo è una cavità o fenditura Il sito attivo occupa una piccola parte del volume totale dell enzima Il sito attivo è formato da residui anche distanti nella sequenza amminoacidica Il substrato interagisce con il sito attivo mediante interazioni deboli

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8 Specificità di substrato Proteasi

9 Specificità di substrato Tripsina Trombina

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11 S k 1 P Vo Vo = k 1 [S] [S]

12 S + E k 1 k 2 k -1 ES E + P k -2 Stadio I S + E k 1 k 2 Stadio II 1. Formazione di un complesso ES 2. Stadio I veloce e Stadio II più lento 3. [ P] è bassa, praticamente 0, perché si misura la velocità iniziale, quindi si ignora la reazione inversa: 4. [E ] << [S] k -1 ES E + P Vo = k 2 [ES] 5. Cinetica alla stato stazionario

13 Stato stazionario E t = ES + E Stato prestazionario

14 Equazione di Michaelis-Menten V o = V max [S] K m + [S]

15 K m Concentrazione di substrato che determina metà della velocità massima K m = k -1 + k 2 se k 2 << k -1 k 1 K m = k -1 k 1 = K d = [E] [S] [ES] ES k -1 k 1 S + E

16 S + E k 1 k -1 ES k 2 E + P K m = k -1 + k 2 k 1 se k -1 << k 2 K m = k 2 k 1

17 ATP + glucosio esochinasi ADP + glucosio-6-p Enzima Substrato Km (mm) Esochinasi D-Glucosio D-Fruttosio

18 se K m << [S] V o = V max [S] K m + [S] se K m >> [S] V o = V max [S] K m + [S]

19 S + E k 1 k 2 k -1 ES E + P V o = k 2 [ES] V o max = k 2 [E t ] k 1 S + E ES EP E + P k -1 k -2 k 2 k 3 V o = k 3 [EP] V max = k 3 [E t ]

20 V o = k 2 [ES] V max = k 2 [E t ] V o = k 3 [EP] V max = k 3 [E t ] k 2, k 3.etc = k cat V max = k cat [E t ] k cat = V max [E t ] La k cat è il numero di turnover di un enzima ed è definito come il numero di molecole di substrato convertite in prodotto da una molecola di enzima nell unità di tempo quando l enzima è saturato con il substrato

21 Numero di turnover (k cat ) di alcuni enzimi Enzima Substrato K cat (sec -1 ) Catalasi H 2 O 2 Anidrasi carbonica HCO - 3 Acetilcolinesterasi Acetilcolina β-lattamasi Benzilpenicillina Fumarasi Fumarato Lisozima Glicano 0.5

22 Costante di specificità o efficienza catalitica = k cat K m k cat = k 2 K m = k -1 + k 2 k 1 Costante di specificità o efficienza catalitica = k 2 X k 1 k -1 + k 2 k 2 >>> k -1 Costante di specificità o efficienza catalitica = k 2 X k 1 k -1 + k 2

23 Grafico di Lineweaver-Burk 1 K m 1 1 =. + V o V max [S] V max y = mx + n

24 Grafico di Eadie-Hofstee V o = V max - K m V o [S] o Pendenza o

25 L Unita enzimatica è la quantità di enzima che catalizza la trasformazione di 1 µmole di substrato in prodotto in un minuto, a 25 C e in condizioni ottimali

26 Vo Vo

27 ATP + glucosio esochinasi ADP + glucosio-6-p Meccanismo sequenziale Reazione enzimatica con formazione di un complesso ternario Ordine casuale Ordinata

28 Meccanismo sequenziale casuale idrolisi Fosfocreatina Creatina ADP + Pi ATP Creatina chinasi + ADP + Pi ATP +

29 Meccanismo sequenziale casuale Creatina chinasi

30 Meccanismo sequenziale ordinato

31 Meccanismo sequenziale ordinato

32 Meccanismo a doppio spostamento (ping pong) Reazione enzimatica senza formazione di un complesso ternario

33 amminotransferasi o transamminasi α-chetoglutarato L-Amminoacido L-Glutammato α-chetoacido E E-NH 3 + (E ) L-Amminoacido 1 substrato (S 1 ) α-chetoacido 1 prodotto (P 1 ) E-NH 3 + (E ) E α-chetoglutarato 2 substrato (S 2 ) L-Glutammato 2 prodotto (P 2 )

34 Meccanismo sequenziale

35 Meccanismo a doppio spostamento (ping pong)

36 Reversibile Irreversibile Inibizione

37 Inibizione competitiva

38 Succinato deidrogenasi Succinato Fumarato

39 Malonato Succinato

40 V o = V max [S] K m + [S] V o = V max [S] K m (1 + [I]) + [S] i K m = K m α K i α 1 K m 1 1 =. + V o V max [S] V max 1 αk m 1 1 =. + V o V max [S] V max

41 Inibizione competitiva K [E] [S] d = [ES] Vmax V o K i = [E] [I] [EI] Vmax 2 K m [S] 1 [S] 2 [S] 3 Vo = k 2 [ES] V max = k 2 [E t ]

42 1 αk m 1 1 =. + V o V max [S] V max Inibizione competitiva - 1 k m - 1 αkm 1 Vmax

43 Inibizione acompetitiva Vo = k 2 [ES] V max = k 2 [E t ] K i = [ES] [I] [ESI]

44 1 K m 1 α. + V o V max [S] V max α Vmax i 1 Vmax - α K m - 1 k m

45 Inibizione non competitiva mista

46 Inibizione non competitiva mista K d K i K d + I K [E] [I] i K = i = [EI] [ES] [I] [EIS] α = 1 + [I] K i α = 1 + [I] K i

47 Inibizione non competitiva mista

48 Inibizione non competitiva pura

49 Inibizione non competitiva pura Vo = k 2 [ES] V max = k 2 [E t ] V o Vmax 2 1 Vmax Vmax 2 2 K m

50 V o = V max [S] K m + [S] i K cat = K cat α V max = k cat [E t ] V o = k cat [E t ][S] K α = 1 + [I] m + [S] K i V o = i K cat [E t ] [S] K m + [S] α V o = K cat /(1 + [I]/K i )[E t ] K m + [S] [S]

51 Inibizione non competitiva pura 1 αk m 1 α =. + V o V max [S] V max - 1 k m

52 L inibitore compete con il substrato per il legame al sito attivo Il legame del substrato permette il legame successivo dell inibitore Il legame dell inibitore ad un sito diverso dal sito attivo distorce l enzima

53 serina Inibizione irreversibile

54 Gli inibitori irreversibili sono utili per individuare i gruppi funzionali coinvolti nel meccanismo catalitico dell enzima

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56 Peptidoglicano della parete cellulare Sito di rottura ad opera del lisozima Estremità riducente Acido N-acetilmuramico N-acetilglucosammina Ponte trasversale di pentaglicina La transpeptidasi catalizza la formazione del legame tra la D-Ala e la L-Gly

57 2 Ponte trasversale di pentaglicina

58 Penicillina

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