Se il sito attivo fosse perfettamente complementare al substrato la reazione non procederebbe. Substrato

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1 Se il sito attivo fosse perfettamente complementare al substrato la reazione non procederebbe Substrato Nelson Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

2 La specificità del legame enzima/substrato può essere spiegata col modello chiave-serratura di Fisher Il sito attivo possiede dei punti di ancoraggio specifici per i gruppi funzionali del substrato Il potere catalitico di un enzima può essere spiegato col modello dell adattamento indotto di Koshland L enzima ha un sito che può alloggiare in modo specifico un substrato ma questo sito diventa complementare al substrato solo nello stato di transizione e solo attraverso un cambiamento conformazionale dell enzima stesso

3 Quando si forma il complesso ES nel distorcere il substrato l enzima stesso cambia conformazione adattando perfettamente la forma del sito catalitico allo stato di transizione del substrato e presentando ad esso i suoi gruppi catalitici. esochinasi (è una trasferasi: trasferisce sul C-6 del glucosio un gruppo fosfato donato dall ATP e produce glucosio-6-fosfato)

4 velocità di reazione Effetto della temperatura sulla velocità di una reazione enzimatica La velocità di reazione aumenta all aumentare della temperatura sino a raggiungere un valore massimo (Mantenendo costanti ph, [E] e [S]) Optimum di temperatura: è diverso per i diversi enzimi A T superiori a quella ottimale: - sono alterate le interazioni che consentono la formazione di ES; - l enzima va incontro a modificazioni strutturali del sito attivo (rottura dei legami deboli, denaturazione)

5 Velocità di reazione Effetto del ph sulla velocità di una reazione enzimatica Da ricollegare al diverso stato di protonazione delle catene laterali di residui amminoacidici che costituiscono il sito catalitico e il sito di legame per il substrato.

6 velocità di reazione Cys-25 Massima attività Cys-25 His-159 His-159 Cys-25 PAPAINA = enzima proteolitico, scinde i legami peptidici delle proteine. Nel sito attivo sono presenti una cisteina molto acida e un istidina molto basica. FORMANO UNA COPPIA IONICA His ph Massima attività: intervallo di ph compreso fra i pka di due residui amminoacidici del sito attivo (fra ph 4.2 e 8.2). In questo intervallo le catene laterali di entrambi i residui amminoacidici sono ionizzati. O=C l HN C H l CH 2 l H C N+ CH C N H H O=C l HN C H l CH 2 l S His-159 (pk R 8.2) Cys-25 (pk R 4.2)

7 1) Perché studiare la cinetica di una reazione enzimatica? Per determinare dei parametri specifici e caratterizzanti per un dato enzima che ci dicono: - Quanto un enzima è affine ad un dato substrato - Quanto l enzima è efficiente - Come posso controllare la velocità della reazione - Come posso regolare l attività catalitica dell enzima (inibendolo o attivandolo) 2) Cosa devo misurare per studiare la cinetica enzimatica? LA VELOCITA DI REAZIONE AL TEMPO ZERO IN FUNZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI SUBSTRATO (misurata come variazione della concentrazione di prodotto ottenuto nel tempo, o di substrato consumato nel tempo) 3) Come interpreto i dati ottenuti? Applico delle equazioni matematiche. Il modello matematico BASE per elaborare i dati di una cinetica enzimatica (per enzimi non allosterici) è quello proposto da L. Michaelis e M. Menten (1913)/Haldane e Briggs (1925)

8 CINETICA ENZIMATICA Gli esperimenti di cinetica enzimatica si basano sulla determinazione della velocità di reazione, misurata come variazioni della concentrazione del prodotto o del reagente in un dato intervallo di tempo. S P v = Δ[P] = _ Δ[S] Δt Δt [S] [P] = aumenta nel tempo [S]= diminuisce nel tempo [P] Col procedere della reazione le curve cinetiche si appiattiscono: la velocità non subisce variazioni. S è consumato perché trasformato in P e la reazione tenderà a raggiungere l equilibrio. tempo

9 S P v = Δ[P] = _ Δ[S] Δt Δt [S] [P] = aumenta nel tempo [S]= diminuisce nel tempo [P] Problema: Voglio misurare in che modo varia la velocità della reazione se uso diverse concentrazioni di substrato (1, 5, o 10 mm, per es ). tempo Devo misurare la velocità della reazione al MOMENTO INIZIALE (entro i primi sec), quando la quantità di prodotto formato è molto bassa e la concentrazione del substrato ha un valore preciso che conosco (quello iniziale stabilito dallo sperimentatore). In questo modo posso associare al valore di [S] utilizzato un dato valore di V 0 (velocità iniziale)

10 COME DETERMINO LA VELOCITA INIZIALE? Studio di una reazione enzimatica semplice (1 solo substrato e 1 solo stadio intermedio): 1) miscelo l enzima con il suo substrato, lavoro a temperatura e ph costanti, 2) Preparo un certo numero di miscele di reazione in cui la [E] è inalterata, ma la [S] è diversa: per ogni esperimento misuro come varia la velocità di reazione nel tempo. 3) Velocità di reazione: misuro la concentrazione di prodotto che si formerà in tempi diversi nelle diverse miscele di reazione. La velocità di reazione aumenta all aumentare della concentrazione del substrato utilizzata. v = Δ[P] = _ Δ[S] Δt Δt v = k [S] k = -1/Δt (costante di velocità specifica per ogni reazione) -Reazione di 1 ordine- v = Δ[P] = _ Δ[S] Δt Δt

11 4) Calcolo il valore della velocità di reazione nello stadio iniziale (v 0 ) alle diverse [S]. VELOCITA INIZIALE (v 0 ) è calcolata come pendenza della tangente alla curva cinetica. Per ognuna delle curve cinetiche ottenute a diverse [S] viene calcolata la v 0 (4) v 0 (3) v 0 (2) v 0 (1) Ogni punto rappresenta un diverso esperimento, ed è definito da due parametri: v 0 e [S] v 0 = k [S] La v 0 è direttamente proporzionale alla concentrazione di reagente [S] usata per la reazione. Per gli enzimi che seguono la cinetica di Micaelis- Menten la dipendenza della v 0 dalla [S] è descritta da una curva iperbolica

12 Velocità iniziale v 0 (μm/min) ENZIMI CHE SEGUONO LA CINETICA DI MICHAELIS-MENTEN Inserendo in un grafico i valori di v 0 ottenuti per le diverse [S] utilizzate ottengo una curva iperbolica Alte [S] = la v 0 non varia molto al variare di [S], l enzima è quasi completamente saturato, viene raggiunta asintoticamente una velocità di reazione massima. La v 0 non dipende più da [S]. Basse [S] = la velocità di reazione v 0 dipende strettamente dalla [S], aumenta all aumentare della [S] Concentrazione substrato [S] (mm) Posso spiegare questo comportamento con un equazione che correla la v 0 alla [S], alla Vmax e ad una costante di affinità (Km)

13 ENZIMI CHE SEGUONO LA CINETICA DI MICHAELIS-MENTEN Mostrano una dipendenza della velocità iniziale (v 0 ) dalla concentrazione di substrato di tipo IPERBOLICO. Catalizzano una reazione enzimatica che nel caso più semplice prevede: 1 prima tappa veloce e reversibile (ΔG minore e k maggiore) S + E k 1 k -1 ES 1 seconda tappa lenta e irreversibile (ΔG maggiore e k minore) che determina la velocità globale di reazione ES k 2 k -2 E + P k 1 = cost cinetica reazione di formazione del complesso ES k -1 = cost cinetica reazione di decomposizione del complesso ES in E + S k 2 = cost cinetica reazione di decomposizione del complesso ES in E + P k -2 = talmente piccola da essere trascurabile

14 v = k 1 [E] + [S] v = k 2 [ES] 1a tappa: Passaggio rapido k 1 k 2 S + E ES E + P k -1 2a tappa: Passaggio lento v = k -1 [ES] La v 0 GLOBALE della reazione enzimatica dipende da [ES] Questa equazione non è sufficiente a spiegare la relazione iperbolica esistente tra v 0 e [S]. v 0 = k 2 [ES] [ES] = non è facilmente misurabile, e k 2 non è nota Bisogna ricavare un equazione alternativa partendo dalla considerazione che la [ES] rimane costante nel tempo della reazione, e che la 1a tappa della reazione enzimatica raggiunge rapidamente lo STATO STAZIONARIO k 1 S + E ES k -1

15 COMPLESSIVAMENTE [ES] RIMANE COSTANTE NEL TEMPO La concentrazione dell enzima libero [E] in soluzione diminuisce man mano che aumenta la concentrazione del complesso [ES]. Ma poiché il complesso ES è demolito continuamente (in E + S o in E + P), l ENZIMA è di nuovo reso libero. STATO STAZIONARIO

16 [ES] rimane costante: la velocità della sua formazione è uguale alla velocità della sua demolizione Velocità di Formazione di ES (E + S ES): V = k 1 [E] [S] = k 1 ([E] TOT [ES]) [S] k 1 k 2 S + E ES k E + P -1 k -1 k 2 Velocità di Demolizione di ES (ES S + E..ES P + E): V = k -1 [ES] + k 2 [ES] [E] = [E] TOT [ES] poiché la concentrazione TOTALE di Enzima è [E] TOT = [E] + [ES] Se è raggiunto lo stato stazionario posso dire che: V formazione ES = V demolizione ES k 1 ([E] TOT [ES]) [S] = k -1 [ES] + k 2 [ES] Riarrangiando l equazione tramite operazioni algebriche si ottiene che: ([E] TOT [ES]) [S] = ( k -1 + k 2 ) k -1 + k 2 [ES] k 1 K m = k 1 Costante di Michaelis-Menten

17 K m = k -1 + k 2 k 1 Costante di Michaelis-Menten Il rapporto fra le costanti cinetiche della dissociazione di ES e quella della sua formazione è uguale alla COSTANTE DI DISSOCIAZIONE DEL COMPLESSO ES Semplificando i termini dell equazione precedente si ottiene che: Poiché la v 0 globale di reazione è : v 0 = k 2 [ES] e quindi: [ES] = v 0 / k 2 [ES] = [E] TOT [S] [S] + K m v 0 = k 2 [E] TOT [S] [S] + K m

18 v 0 = k 2 [E] TOT [S] [S] + K m k 2 [E] TOT = Vmax Introduciamo un altro parametro importante: la Velocità massima di reazione. Quando sono presenti nella miscela di reazione concentrazioni saturanti di substrato, allora, tutto l enzima è complessato col substrato e la [E] TOT = [ES] La velocità globale di reazione non dipende più dalla concentrazione di substrato, ma solo dalla concentrazione totale dell enzima: v 0 = k 2 [ES] diventa Vmax = k 2 [E] TOT v 0 = Vmax [S] [S] + K m EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN

19 v 0 (μm/min) Equazione di Michaelis-Menten v 0 = Vmax [S] Km + [S] La velocità iniziale della reazione enzimatica dipende dalla [S] in modo iperbolico ed è correlata alla Vmax (= k 2 [E] tot ) e alla Km Il valore della Km si può determinare sperimentalmente = Corrisponde alla [S] alla quale raggiungo la metà della Vmax. Ha le unità di misura di una concentrazione k 1 k 2 S + E ES E + P k -1 [S] (mm) v 0 = ½ Vmax = Vmax [S] [S] + Km 1 [S] = 2 [S] + Km Km + [S] = 2 [S] Km = [S] Solo se v 0 = ½ Vmax

20 Km = k -1 + k 2 k 1 (k 2 << k -1 = trascurabile) La Km è uguale alla costante di dissociazione del complesso ES Km = La Km fornisce informazioni sull affinità che un enzima ha nei confronti del suo substrato ed è SPECIFICA per ogni diverso enzima nei confronti di un dato substrato. Più è grande, minore sarà l affinità dell enzima per il substrato (maggiore sarà la costante di dissociazione del complesso ES, k -1 > k 1 ) Più è piccola maggiore sarà l affinità (minore la costante di dissociazione di ES, k 1 > k -1 ) Considerazioni valide per reazioni enzimatiche semplici a due tappe e in cui k 2 << k -1, non per tutti gli enzimi, molte reazioni enzimatiche sono a più tappe e la Km diventa una funzione più complessa che dipende da varie costanti cinetiche. k -1 k 1

21 La Km fornisce informazioni sulla efficienza della catalisi e sul controllo della velocità se [S] >> 10 Km concentrazioni saturanti di substrato, la reazione è molto efficiente perché quasi a Vmax, ma non controllabile variando la [S] se [S] << 0.1 Km concentrazioni bassissime di substrato, la reazione non è efficiente ma la si può controllare variando [S], poiché la v 0 aumenta all aumentare della [S]. [S] >> 10 Km Nelle cellule [S] Km la reazione ha velocità intermedia ed è regolabile variando [S] [S] << 0.1 Km Berg et al., BIOCHIMICA 6/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2007

22 v 0 (μm/min) 1 enzima 2 substrati simili A e B medesime condizioni di reazione Verso quale dei due l enzima è più affine? A A B ½ Vmax Km A Km B [S] mm

23 Costante catalitica o n di Turnover k 1 k 2 S + E ES E + P k -1 Vmax = k 2 [ES] = k 2 [E] TOT k Vmax 2 = [E] TOT k 2 per una reazione semplice ad uno stadio corrisponde alla k cat (costante catalitica) Indica il numero di eventi catalitici che avvengono nel sito attivo dell enzima nell unità di tempo (le sue unità di misura sono s -1 o min -1 ). Misura quanto velocemente un dato enzima può catalizzare una data reazione. E SPECIFICA per ogni enzima. Se lavoro con una miscela di reazione enzimatica in cui utilizzo una [S] saturante e voglio raddoppiare la velocità di reazione cosa devo modificare nella miscela di reazione? In che modo?

24 v 0 (μm/sec) A [S] saturante la v 0 raggiunge il suo valore massimo (Vmax), non può più variare in funzione della concentrazione di substrato, perché tutto l enzima presente è saturato. Se voglio aumentare la Velocità di reazione devo aggiungere altro enzima alla miscela di reazione. Vmax = k 2 [E] tot per raddoppiare la velocità di reazione (Vmax) devo raddoppiare la concentrazione dell enzima Vmax B = k 2 [E] B [E] B = 2 [E] A Vmax A = k 2 [E] A LA Km RIMANE INVARIATA Km [S] mm

25 EFFICIENZA CATALITICA DI UN ENZIMA Costante di specificità: k cat /Km (M -1 sec -1 ) Parametro che utilizziamo per confrontare l efficienza catalitica e la specificità di enzimi diversi per uno stesso substrato o di uno stesso enzima per substrati diversi. ENZIMA SUBSTRATO kcat (sec -1 ) Km (M) kcat/km (M -1 sec -1 ) Acetilcolinesterasi Acetilcolina 1.4x10 4 9x x10 8 Anidrasi carbonica CO 2 1x x x10 7 Anidrasi carbonica HCO 3-4x x x10 7 Catalasi H 2 O 1.4x10 4 9x x10 8 Fumarasi Fumarato 8x10 2 5x x10 8 Fumarasi Malato 9x x x10 7

26 In reazioni più complesse a più stadi: la k cat corrisponderà alla k 2 dello stadio limitante la velocità della reazione complessiva Oppure in situazioni più complesse sarà uguale alla combinazione di molte costanti di velocità diverse Es: reazione multistadio e multisubstrato a PING PONG Nelson Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

27 1/v 0 min/μm Determinazione sperimentale di Km e Vmax per una reazione enzimatica: GRAFICO DEI DOPPI RECIPROCI (Eq. di Lineweaver-Burk) (linearizzazione della curva iperbolica) >>>> 1 Km 1 1 = + Vmax [S] Vmax I valori sperimentali di v 0 sono trasformati nei loro reciproci: 1/v 0 e i valori sperimentali di [S] nei corrispettivi reciproci 1/[S] v 0 La curva iperbolica del grafico di Micaelis- Menten diventa una retta che interseca gli assi in punti precisi consentendo di determinare con esattezza Km e Vmax, e quindi anche k cat 1/v 0 = 1/Vmax -1/Km [S] = 10 mm 0,1 Pendenza della retta = Km/Vmax 1/[S] mm -1 [S] = 1,0 mm 1,0

28 v 0 (μm/min) 1/v 0 min/μm 1/Vmax = 0,02-0,5 = -1/Km Vmax [S] = 10 mm 0,1 50 μm/min 1/[S] mm -1 [S] = 1,0 mm 1,0 Per calcolare la Vmax devo fare il reciproco del reciproco = 1 = 0,02 min/μm Vmax = 1 Vmax 0,02 min/ μm Vmax = 50 μm/min Per calcolare il valore della Km devo fare il reciproco negativo del reciproco = -1/Km = -0,5 mm -1 Km = - 1 = 2mM -0,5 mm -1 1 Km 1 1 v = 0 Vmax [S] + Vmax Vmax 2 v 0 = Vmax [S] Km + [S] 2,0 (Km) [S] mm