Enzimi: catalizzatori biologici

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1 Enzimi: catalizzatori biologici praticamente tutte le reazioni biochimiche della chimica della vita sono catalizzate da enzimi gli enzimi sono proteine la velocità di reazioni enzimatiche è aumentata di fattori rispetto alle stesse reazioni non catalizzate le condizioni biologiche di reazione sono moderate: T<100 oc, Patm, ph 7, soluzioni acquose gli enzimi hanno un elevatissimo grado di specificità l attività degli enzimi è regolata

2 Ssistema+ Suniverso > 0 spontaneo Energia libera di Gibbs Nei sistemi biologici V è molto piccolo G negativo spontaneo G positivo non spontaneo G=0 equilibrio

3 Il G di una reazione dipende solo dalla differenza di energia libera dei prodotti (stato finale) e dei reagenti (stato iniziale) è lo stesso La VELOCITA della reazione non è prevedibile in base al G

4 Teoria della velocità di reazione o dello stato di transizione i reagenti devono incontrarsi (collidere) i reagenti devono aver sufficiente energia per raggiungere lo stato di transizione i reagenti devono essere orientati correttamente nello stato di transizione normalmente, gli angoli di legame e le lunghezze di legame sono distorti verso quelli caratteristici dei prodotti

5 Effetto della temperatura e di un catalizzatore sulla velocità di reazione Equazione di Arrhenius: k = Aexp(-Ea/RT) ln k = lna -Ea/RT Ea = energia di attivazione la velocità dei reazione è proporzionale: alla frequenza degli urti molecolari alla probabilità che l urto avvenga con energia sufficiente a far avvenire la reazione I catalizzatori riducono l energia di attivazione

6 CINETICA CHIMICA La stechiometria di una reazione chimica non specifica il meccanismo della reazione A P una reazione è descritta da reazioni elementari A I1 I2 P intermedi Generalmente una reazione avviene in molte tappe (meccanismo) Spesso uno step è il più lento e determina la velocità della reazione (rate determining step)

7 gli intermedi di reazione non sono gli stati di transizione A k1 I k2 I = intermedio P

8 I catalizzatori riducono l energia di attivazione Proprietà di un catalizzatore è presente in piccole quantità non catalizzata non viene alterato dalla reazione fa aumentare la velocità di reazione ma non sposta l equilibrio catalizzata facilita la reazione in entrambi i sensi è specifico per la reazione coordinata di reazione aumento della velocità di reazione

9 Fattori responsabili dell aumento della velocità nella catalisi enzimatica Le reazioni non catalizzate possono essere lente in quanto: coinvolgono la formazione di cariche positive e/o negative nello stato di transizione richiedono spesso che molecole vengano in stretto contatto con concomitante perdita di entropia Queste difficoltà vengono superate con gli enzimi: le cariche vengono stabilizzate piazzando acidi, basi, ioni metallici, o dipoli che fanno parte della struttura dell enzima nel sito attivo catalisi covalente viene utilizzata per percorrere cammini di reazione a bassa energia le perdite di entropia sono minimizzate in quanto i gruppi catalitici sono parte della struttura dell enzima

10 Definizioni importanti per l attività e proprietà degli enzimi sito attivo substrato coenzima o cofattore velocità di reazione attivatore inibitore

11 L enzima lega il substrato nel proprio sito attivo Modello chiave-serratura Adattamento indotto l enzima forza il substrato ad assumere una conformazione simile allo stato di transizione

12 La distorsione indotta può essere localizzata od estesa a gran parte dell enzima D-glucosio esochinasi

13 Le interazioni Enzima-Substrato legami a H forze di van der Waals forze elettrostatiche Residui idrofobici Legami multi-contatto E+S ES N.B gli enzimi non si limitano a posizionare e/o distorcere i substrati abbassando l energia di attivazione, ma promuovono l evento catalitico utilizzando residui opportunamente posti

14 I siti attivi includono generalmente residui anche lontani nella sequenza primaria Lisozima:enzima che catalizza la reazione di rottura delle pareti cellulari di alcuni batteri I siti attivi occupano una parte relativamente piccola del volume totale dell enzima, che comprende anche siti regolatori, di interazione, canali etc

15 POCHI PRINCIPI CATALITICI DI BASE SONO USATI DA MOLTI ENZIMI Catalisi acido-base Catalisi con ioni metallici (elettrofili) Catalisi per prossimità (reazioni a più substrati) Catalisi covalente

16 Ex. 1 Trioso-fosfato isomerasi reazione della glicolisi sito attivo

17 Il sito attivo: legame con DHAP Il residuo di acido glutammico Glu 165 è essenziale per la funzione enzimatica Ansa protettiva Glu Lys His Lys His Glu

18 L enzima in assenza e in presenza del substrato Lys-P del substrato His- C1 e C2 Glu- C1 e C2

19 Reazione acido-base catalizzata concertata G3P-enzima DHAP-enzima Stato di transizione Stato di transizione Intermedio endiolico

20 E+G-3P E-G3P E-ed E-DHAP E-G-3P E-ed E-DHAP E+DHAP destabilizzazione dell enediolo

21 Asp His Ser sono sempre presenti nel sito attivo Proteasi seriniche la reazione consiste nell idrolisi di legami peptidici dal lato carbossilico di particolari AA chimotripsina un residuo di serina gioca un ruolo importante nella catalisi di tipo covalente

22 I POLIPEPTIDI SONO MOLECOLE METASTABILI L idrolisi del legame peptidico è termodinamicamente favorita rispetto alla formazione del legame (condensazione G0=+10kJmol-1) La formazione del legame avviene con l utilizzo di ATP, per azione di aminoaciltrna-sintetasi che attivano gli AA nel legame con trna 1. AA+ATP Amminoacil-AMP + PPi 2. Amminoacil-AMP +trna trna Amminoacil-tRNA + AMP Il legame peptidico a partire dagli amminoacil-trna è termodinamicamente favorito

23 chimotripsina: residui del sito attivo La differenza tra gli enzimi riguarda la tasca vicina alla Ser (responsabile della specificità delle proteasi) chimostripsina idrolizza i legami la cui porzione carbossilica è un residuo idrofobico (Phe, Leu) tripsina idrolizza i legami la cui porzione carbossilica è un residuo basico (Lys Arg)

24 Meccanismo catalitico Phe buco dello ossianione La Ser attivata è un forte nucleofilo: attacco al carbonile del substrato

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26 La stabilizzazione degli stati di transizione (stabilizzazione dell ossianione tetraedrico) e il corretto posizionamento dei reagenti abbassano l energia di attivazione

27 Stabilizzazione dell intermedio tetraedrico: buco ossianionico

28 La triade catalitica è conservata in varie famiglie di proteasi, sia batteriche che virali, che di animali e piante (evoluzione convergente)

29 Le tasche di alloggiamento del substrato rendono selettivo il taglio proteolitico Phe, Leu Arg,Lys Ala,Ser

30 PROTEASI NON SERINICHE Il sito attivo presenta caratteristiche per l attivazione di un nucleofilo per l attacco al carbonile e una stabilizzazione dell intermedio tetraedrico

31 Inibitori di proteasi sono spesso farmaci importanti crixivan Proteasi dell HIV: aspartil proteasi deputata a convertire alcune proteine virali in forma attiva per proteolisi specifica Inibitore altamente specifico (a livello delle falde) non in grado di inattivare le proteasi umane