Prof. Giorgio Sartor. Cinetica enzimatica. Spontaneità
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1 Prof. Giorgio Sartor Cinetica enzimatica Copyright by Giorgio Sartor. All rights reserved. B06 - Versione Mar-17 Spontaneità Una qualunque reazione chimica avviene se e solo se la variazione di energia libera ( G) è negativa: spontaneamente GT,p < 0 GT = T S A T e p costanti v gsartor B06 - Cinetica enzimatica -2-1
2 Spontaneità Quindi, data una qualunque reazione chimica A B Essa avviene spontaneamente se le energie libere molari G B < G A Più in generale qualunque trasformazione avviene se e solo se: G finale < G iniziale v gsartor B06 - Cinetica enzimatica - 3- Spontaneità ed equilibrio Quando G B = G A Quindi G = 0 La reazione è all equilibrio A B v gsartor B06 - Cinetica enzimatica - 4-2
3 Spontaneità e realtà Questo non significa che una reazione chimica (un processo) esoergonica ( G < 0) avvenga con velocità apprezzabile. ATP + 2 P P P.. 2 ADP + Pi P + P P 2 G = -7.3 kcal mole -1 (-30.6 kj mole -1 ) a p 7 v gsartor B06 - Cinetica enzimatica - 5- Energia di attivazione In soluzione l ATP è stabile perché esiste l energia di attivazione. v gsartor B06 - Cinetica enzimatica - 6-3
4 Catalisi In assenza di catalizzatore: A + B C + D v gsartor B06 - Cinetica enzimatica - 7- Catalisi G = Energia di attivazione Energia libera A + B G G C + D Coordinate di reazione v gsartor B06 - Cinetica enzimatica - 8-4
5 Catalisi In presenza di catalizzatore: A + K AK AK + B ABK ABK C + D + K v gsartor B06 - Cinetica enzimatica - 9- Catalisi G c = Energia di attivazione in presenza di catalizzatore Energia libera G c A + B + K G AK + B C + D + K Coordinate di reazione v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
6 Controllo termodinamica e controllo cinetico di una reazione gni reazione può avvenire se e solo se è termodinamicamente favorita ( G < 0), Avviene se e solo se vi è abbastanza energia per superare l energia di attivazione: ½ 2 Catalizzatore : essuno = 18 kcal mole -1 Platino = 11.7 kcal mole -1 Catalasi = 5.5 kcal mole -1 ( = energia di attivazione) v gsartor B06 - Cinetica enzimatica In una reazione chimica A B v = k [A] Velocità di reazione [A] v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
7 Una reazione enzimatica k 1 k E + S ES 2 E + P k -1 ES EP v gsartor B06 - Cinetica enzimatica In una reazione enzimatica E + S ES E + P Velocità di reazione Bassa concentrazione di substrato >[E] v = k' [E o ] Alta concentrazione di substrato >>[E] v = k'' [E o ] v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
8 Enzimi Gli enzimi sono sistemi catalitici, in genere proteine v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Enzimi Gli enzimi sono sistemi catalitici, in genere proteine v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
9 Specificità degli enzimi Specificità Stereochimica Assoluta Di gruppo Di legame v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Specificità degli enzimi Specificità stereochimica steroide 11-β-monossigenasi β-idrossi steroide v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
10 Specificità degli enzimi Specificità assoluta mannitolo-1-fosfato deidrogenasi C 2 C 2 C 2 P 3 - C 2 P 3 - mannitolo-1-fosfato fruttoso-6-fosfato v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Specificità degli enzimi Specificità di gruppo Proteasi -Leu-Arg-Gly-Phe- Taglia qui v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
11 Centro catalitico is57 Asp102 Ser195 v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Meccanismo delle proteasi a serina v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
12 Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 Ser195 Gly193 E Sito Specifico v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 ES R is57 R Ser195 Gly193 Sito Specifico v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
13 Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 Intermedio tetraedrico R + is57 R Ser195 Gly193 Sito Specifico v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 R + is57 R Ser195 Gly193 Sito Specifico v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
14 Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 Ser195 Gly193 R R Acilenzima Sito Specifico v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 R is57 R Sito Specifico Ser195 Gly193 v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
15 Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 Ser195 Gly193 R Sito Specifico v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 + Intermedio tetraedrico R Ser195 Gly193 Sito Specifico v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
16 Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 + R Ser195 Gly193 Sito Specifico v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 R Ser195 Gly193 Sito Specifico v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
17 Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 Ser195 Gly193 Sito Specifico v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Meccanismo delle proteasi a serina v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
18 Proteasi a serina (1AX) v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Proteasi a serina (1AX) Gly193 Ser195 is57 v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
19 Specificità degli enzimi Specificità di legame Esterasi Estere Acido + Alcool v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Classificazione degli enzimi Singolo enzima Ureasi Complesso enzimatico Complesso piruvato deidrogenasi v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
20 Classificazione gerarchica degli enzimi gni enzima viene classificato a secondo della reazione che catalizza. Viene classificato con un numero: EC X.Y.Z.T X = classe Y = sottoclasse Z = sotto-sottoclasse T = numero dell enzima nella sottosottoclasse v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Classificazione gerarchica degli enzimi Classi: 1. ssidoreduttasi Catalizzano una reazione redox. 2. Transferasi Catalizzano il trasferimento di un gruppo da una molecola ad un altra: X-Y + Z X-Z + Y le chinasi trasferiscono un gruppo fosfato. 3. Idrolasi Catalizzano la scissione idrolitica di legami C=, C-, C-C, P--P, v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
21 Classificazione gerarchica degli enzimi Classi: 4. Liasi Catalizzano scissioni di legami con meccanismi diversi dalle ssidoreduttasi e dalle Idrolasi. 5. Isomerasi Catalizzano modificazioni geometriche. 6. Ligasi (Sintetasi) Catalizzano l unione di due molecole accoppiata al consumo di ATP o di un altro nucleotide trifosfato. v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Classificazione gerarchica degli enzimi Per esempio: Alcool + AD + Aldeide o chetone + AD ome comune: alcool deidrogenasi ome sistematico: alcool:ad + ossidoreduttasi EC umero dell enzima nella sotto-sottoclasse La sotto-sottoclasse con AD + o ADP + come accettori La sottoclasse Agiscono sul gruppo di donatori C- La classe - ssidoreduttasi v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
22 v gsartor B06 - Cinetica enzimatica v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
23 v gsartor B06 - Cinetica enzimatica v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
24 Isoenzimi Questa classificazione riguarda gli enzimi in quanto proteine ma in quanto CATALIZZATRI La classificazione riguarda quindi gli enziomi che catalizzano una reazione. Proteine diverse (con diversa struttura primaria) che catalizzano la stessa reazione, sono ISEZIMI v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Isoenzimi Sono le forme multiple dovute a differenze, determinate geneticamente, di struttura primaria Sono anche isoenzimi quelle proteine che svolgono la stessa funzione ma sono geneticamente indipendenti, per esempio: EC malato deidrogenasi Citosolica (codificata dal DA nucleare) Mitocondriale (codificata dal DA mitocondriale) v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
25 Cenni di cinetica chimica A k 1 k -1 B All equilibrio Velocità diretta v 1 = - Velocità inversa v -1 = - d[a] dt d[b] dt = k 1 [A] = k -1 [B] v 1 = v -1 k 1 [A] eq = k -1 [B] eq k 1 k -1 [B] eq = = K [A] eq eq v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Cenni di cinetica chimica rdine di reazione I ordine II ordine I ordine rispetto ad A I ordine rispetto a B II ordine globale v 1 = k 1 [A] v 1 = k 1 [A] 2 oppure v 1 = k 1 [A][B] rdine 0 v 1 = k 1 indipendente dalla concentrazione dei reagenti v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
26 Dipendenza dalla temperatura La velocità di una reazione dipende dalla temperatura attraverso la costante di velocità k v = k[a] All equilibrio k = A e - E att1 RT k A 1 e - E att1 RT 1 K - eq = = = Z e k -1 E - att1 A -1 e RT E att RT v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Dipendenza dalla temperatura K eq = Z e - E att RT = Z e - G - T S RT = Z e - RT S = Z e - RT - R K eq = e - RT lnk eq =- RT E att 1 Energia Reagenti E att -1 E att 1 -E att -1 = E att E att Η Prodotti Coordinate di reazione v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
27 Dipendenza dalla temperatura ln K eq ln K eq = - /R 1/T pendenza = - /R 1/T (K) v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Dipendenza dalla temperatura All equilibrio G = G + RT ln [Prodotti] [Reagenti] [Prodotti] [Reagenti] = K eq ; G = 0 0 = G + RT ln K eq G = - RT ln K eq G = - T S v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
28 Reazione enzimatica k 1 k E + S ES 2 E + P k -1 ES EP v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Enzima e substrato In una reazione tra enzima (E) e substrato (S), possiamo distinguere tre fasi: 1. Legame tra E e S per formare il complesso ES E + S ES >>[E] d[es] Stato prestazionario 2. Stato stazionario dt = 0; 3. Scompare il substrato, [ES] diminuisce, v diminuisce v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
29 Enzima e substrato Concentrazione [P] [ES] [ES]/ t 0 [E] Tempo v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Enzima e substrato 1 a fase Stato Pre-stazionario 2 a fase Stato stazionario 3 a fase Fine Concentrazione d[p]/dt cost. [P] [ES] [ES]/ t 0 [E] µs ms s m h Tempo v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
30 Enzima e substrato 1 a fase Stato Pre-stazionario 2 a fase Stato stazionario 3 a fase Fine Concentrazione d[p]/dt cost. [P] [ES] [ES]/ t 0 [E] µs ms s m h Tempo v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Enzima e substrato 1 a fase Stato Pre-stazionario 2 a fase Stato stazionario 3 a fase Fine Concentrazione d/dt =cost d[p]/dt cost. d[p]/dt =cost d[es]/dt = 0 d[e]/dt =0 µs ms s m h Tempo v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
31 Enzima e substrato In una reazione enzimatica l ordine di reazione è variabile Velocità di reazione v = k[e] rdine 1 v = k[e] Pseudo ordine 0 v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Enzima e substrato In una reazione enzimatica l ordine di reazione è variabile rdine 1 rdine 0 Velocità Velocità v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
32 Trattamento secondo Michaelis e Menten In una reazione enzimatica >>[E]: k 1 E + S ES (veloce) (1) k -1 k 2 ES E + P (lento) (2) v diretta = k 2 [ES] Per l equilibrio veloce (1) IDETERMIABILE k 1 K = = k -1 [ES] [E] IDETERMIABILE [ES] = k 1 k -1 [E] v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Trattamento secondo Michaelis e Menten Per l equilibrio veloce (1) k 1 K = = k -1 [ES] [E] IDETERMIABILE [ES] = k 1 k -1 [E] [E tot ] misurabile [E tot ] = [E] + [ES] [ES] = k 1 k -1 ([E tot ]-[ES]) v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
33 Trattamento secondo Michaelis e Menten Da cui [ES] = [E tot ] k -1 k 1 + k -1 = K d k 1 Costante di dissociazione del complesso ES ES k -1 E + S [E] [ES] k 1 = K d = Costante di Michaelis e Menten v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Trattamento secondo Michaelis e Menten La concentrazione del complesso ES [ES] = [E tot ] + Poiché: v diretta = k 2 [ES] v diretta = k 2 [E tot ] + v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
34 Trattamento secondo Michaelis e Menten Quando tutto E tot diventa ES allora la velocità sarà massima. = k 2 [E tot ] v = + Quando il substrato satura l enzima allora la velocità sarà massima v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Equazione di Michaelis e Menten v = + v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
35 Michaelis e Menten Leonor Michaelis ( ) Maud Menten( ) v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Efficienza catalitica o numero di turnover k 2 è detta anche k cat e si ottiene: k cat = [E tot ] k 2 è detto anche numero di turnover (Moli di substrato consumate per secondo per moli di enzima) si esprime in s -1. ~1 s -1 < k 2 < 10 6 s -1 v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
36 Trattamento secondo Michaelis e Menten Bassa concentrazione (relativamente) di substrato: << (rdine 1) v = + Velocità di reazione Alta concentrazione di substrato: >> (rdine 0) v = + = TRASCURABILE TRASCURABILE v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Trattamento secondo Briggs-aldane Da un punto di vista formale il trattamento è lo stesso di M.M., cambia il significato cinetico di E + S k 1 ES k 2 k -1 k -2 E + P Allo stato stazionario: d[es] dt = 0 = k 1 [E] - (k -1 [ES] + k 2 [ES]) formazione di ES scomparsa di ES [ES] = k 1 [E] (k -1 + k 2 ) v = + = k -1 + k 2 k 1 v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
37 Significato di descrive l interazione substrato-enzima a livello del sito di legame. è una concentrazione: k [E] -1 = K d = = ; moli l -1 [ES] k 1 È la concentrazione di substrato al quale la velocità della reazione è metà della v = = ; = ; + = v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Significato di E + S k 1 ES k 2 k -1 k -2 E + P è legata a k 2 = k 2 [E tot ] Dipende dalla concentrazione dell enzima: induzione genica, sintesi e degradazione delle proteine. v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
38 Significato di k 2 k 2 è una frequenza /[E tot ] = k 2 (moli l -1 s -1 )/(moli l -1 ) k 2 = s -1 umero di eventi per unità di tempo (numero di turnover). Proprietà cinetica dell enzima. v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Significato di e v = v v = 2 v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
39 Enzima Sorgente Substrato Km (mm) n di turnover (1/s) Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.4 ATP-asi Muscolo di coniglio ATP Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.5 Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica Acido aspartico 0.9 Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale Acido α-chetoglutarico Acido ossalacetico acido glutammico 4 Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA benziltirosinamide 2.5 -formiltirosinamide 12 Chimotripsina Pancreas bovino -acetiltirosinamide 32 gliciltirosinamide 122 Creatina fosfochinasi Muscolo di coniglio Creatina 19 Esochinasi Lievito Glucosio 0.15 Esochinasi Cervello Glucosio Fosfatasi acida Prostata α-glicerofosfato 3 Fosfogliceraldeide deidrogenasi Muscolo di coniglio Gliceraldeide-3-fosfato 0.05 Acido glutammico 0.12 Acido α-chetoglutarico 2 Glutamato deidrogenasi Fegato bovino Ione ammonio 57 AD AD Xantina 0.03 Xantina ossidasi Latte v gsartor B06 - Cinetica Acetaldeide enzimatica Enzima Sorgente Substrato Km (mm) n di turnover (1/s) Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.4 ATP-asi Muscolo di coniglio ATP Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.5 Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica Acido aspartico 0.9 Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale Acido α-chetoglutarico Acido ossalacetico acido glutammico 4 Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA benziltirosinamide 2.5 -formiltirosinamide 12 Chimotripsina Pancreas bovino -acetiltirosinamide 32 gliciltirosinamide 122 Creatina fosfochinasi Muscolo di coniglio Creatina 19 Esochinasi Lievito Glucosio 0.15 Esochinasi Cervello Glucosio Fosfatasi acida Prostata α-glicerofosfato 3 Fosfogliceraldeide deidrogenasi Muscolo di coniglio Gliceraldeide-3-fosfato 0.05 Acido glutammico 0.12 Acido α-chetoglutarico 2 Glutamato deidrogenasi Fegato bovino Ione ammonio 57 AD AD Xantina 0.03 Xantina ossidasi Latte v gsartor B06 - Cinetica Acetaldeide enzimatica
40 Enzima Sorgente Substrato Km (mm) n di turnover (1/s) Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.4 ATP-asi Muscolo di coniglio ATP Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.5 Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica Acido aspartico 0.9 Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale Acido α-chetoglutarico Acido ossalacetico acido glutammico 4 Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA benziltirosinamide 2.5 -formiltirosinamide 12 Chimotripsina Pancreas bovino -acetiltirosinamide 32 gliciltirosinamide 122 Creatina fosfochinasi Muscolo di coniglio Creatina 19 Esochinasi Lievito Glucosio 0.15 Esochinasi Cervello Glucosio Fosfatasi acida Prostata α-glicerofosfato 3 Fosfogliceraldeide deidrogenasi Muscolo di coniglio Gliceraldeide-3-fosfato 0.05 Acido glutammico 0.12 Acido α-chetoglutarico 2 Glutamato deidrogenasi Fegato bovino Ione ammonio 57 AD AD Xantina 0.03 Xantina ossidasi Latte v gsartor B06 - Cinetica Acetaldeide enzimatica Linearizzazione dell equazione di Michaelis e Menten v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
41 Inversione Lineweaver-Burk v = + 1 v + K = = M v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Lineweaver-Burk 1 v K = M /v 1/ Pendenza = / -1/ 0 1/ v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
42 Eadie-ofstee Trasformazione v ( + ) = v + v = v v + = V max v v + = v/[s] / Pendenza = - 1/ v = - v 1 KM v v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Eadie-ofstee (oppure) Trasformazione v ( + ) = v + v = v v + = V max v v + = v Pendenza = - / v v= - + v/[s] v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
43 Reazioni enzimatiche con più substrati Meccanismo sequenziale: i substrati si legano in modo sequenziale: Prima uno poi l altro in ordine preciso: Meccanismo sequenziale ordinato Senza un ordine preciso: Meccanismo sequenziale casuale Meccanismo a ping-pong v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Meccanismo sequenziale ordinato A + B E P + Q E + A EA; EA + B EAB; EAB EPQ; EPQ EQ + P; EQ E + Q v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
44 Meccanismo sequenziale casuale A + B E P + Q E + A EA B Q EP E + P A EAB EPQ P E + B EB EQ E + Q DA PLIMERASI DIIDRFLAT REDUTTASI v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Meccanismo a ping-pong A + B E P + Q E + A EA E'P E' + P E' + B E'B EQ E + Q A P B Q E E'A E'P E' E'B EQ E v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
45 Centro catalitico is57 Asp102 Ser195 v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 E + A R is57 R Ser195 Gly193 Sito Specifico v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
46 Meccanismo delle proteasi a serina E A Asp102 R + is57 R Ser195 Gly193 Sito Specifico v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 E A E P R + is57 R Ser195 Gly193 Sito Specifico v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
47 Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 E P + B R is57 R Sito Specifico Ser195 Gly193 Acilenzima v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Reazioni enzimatiche con più substrati Il trattamento è complesso, occorre fare lo studio cinetico tenendo fissa la concentrazione di uno dei substrati (B) variando l altro (A), così, di grafici di Lineweaver-Burk si può avere una descrizione del meccanismo: [B] 1/v 1/v [B] Sequenziale casuale 1/[A] Ping-pong 1/[A] v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
48 Regolazione dell attività enzimatica I fattori che regolano l attività enzimatica sono: Temperatura Enzimi solubili o di membrana p Effettori Inibitori (inattivatori) Attivatori Effetti allosterici Concentrazione di substrati e prodotti Vie metaboliche Repressione o induzione genica v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Temperatura La velocità delle reazioni chimiche dipende dalla temperatura. La stabilità di una proteina dipende dalla temperatura. Denaturazione Aumento cinetico Velocità optimum Temperatura v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
49 Temperatura La temperatura influenza la fluidità di membrana Ln v Enzima solubile Ln v Enzima di membrana Temperatura di transizione della fase lipidica Temperatura alta 1/T Temperatura Temperatura 1/T bassa alta Temperatura bassa v gsartor B06 - Cinetica enzimatica p La stabilità di una proteina dipende dal p. Alcuni processi coinvolgono valori estremi di p Pepsina Tripsina Aceticolinesterasi Velocità relativa 2 6 p 10 v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
50 Effettori Attivatori Inibitori La differenza non è netta, la stessa molecola può funzionare in entrambi i modi a seconda delle condizioni Carica Concentrazione Enzima legato ad altre molecole v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Inibitori Si definiscono inibitori quelle molecole che diminuiscono l attività di un enzima, possono dare Inibizione reversibile Modificano in modo reversibile (in genere attraverso un legame non covalente) l enzima Inibizione irreversibile Modificano in modo irreversibile l enzima v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
51 Inibitori reversibili A secondo delle loro caratteristiche si definiscono: Inibitori competitivi Inibitori non competitivi Inibitori acompetitivi v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Inibitori competitivi Agiscono competendo con il substrato per lo stesso sito di legame, agiscono quindi sulla formazione del complesso ES. L inibizione è rimossa aumentando la concentrazione di S E + S ES E + P = K i I EI E + P Ki = [E] [ES] [I][E] [EI] v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
52 Inibitori competitivi Senza inibitore v = + v Con inibitore v = ( 1 + [I] K i ) + v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Inibitori competitivi Senza inibitore 1 v K = M /V 1/ Con inibitore 1 v -1/(app) K = M [I] 1 1 ( 1 + ) + K i 0 1/ v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
53 Sono molecole simili al substrato ccupano lo stesso sito di legame Inibitori competitivi SIT ATTIV DELL IZIMA SUBSTRAT IIBITRE PRDTTI SUBSTRAT ED IIBITRE SI LEGA ALL STESS SIT IL LEGAME DELL IIBITRE PREVIEE IL LEGAME DEL SUBSTRAT v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Biosintesi del colesterolo C 3 Viene sintetizzato nelle cellule epatiche a partire da acetil-coa per formare 3-R-mevalonato. C 3 CoA S Acetil-CoA (C n ) CoA CoA S S Tiolasi 3 C C 3 Acetoacetil-CoA S CoA CoA CoA S S MG sintasi MG-CoA reduttasi I riduzione II riduzione APD + ADP idrossi-3-metil glutaril-coa MG-CoA C 3 S CoA ADP + + APD + C 3 3-R-mevalonato S CoA S CoA C 3 Intermedio legato all'enzima v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
54 MG reduttasi EC È una glicoproteina di membrana del reticolo endoplamatico, Il suo peso molecolare è di 97 kd, Il sito attivo è rivolto verso il citoplasma. È anch essa regolata dal sistema protein chinasi. MG CoA ADP v gsartor B06 - Cinetica enzimatica MG reduttasi EC Viene inibita dalle statine, usate come farmaci per ridurre elevati livelli di colesterolo. Mevastatina v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
55 Inibitori competitivi v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Inibitori non competitivi Agiscono legandosi in un sito diverso dal sito di legame del substrato il quale può comunque legarsi. L inibizione è rimossa aumentando la concentrazione di S E + S + I ES + I E + P = [E] [ES] K K i [I][E] i [I][ES] K K i = = M [EI] [ESI] EI + S ESI v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
56 Inibitori non competitivi Senza inibitore v = + v Con inibitore v = [I] ( 1 + ) K i + v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Inibitori non competitivi Senza inibitore 1 v K = M /V 1/ Con inibitore -1/ 0 1/ 1 v K = M [I] 1 1 [I] ( 1 + ) + ( 1 + ) K i K i v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
57 Inibitori non competitivi Sono molecole diverse dal substrato, si legano ad un proprio sito SIT ATTIV DELL IZIMA SIT IIBITRI (REGLATRI) IIBITRE SUBSTRAT Ioni metallici (Cu ++ ) Complessanti (EDTA) Modulatori I ASSEZA DI IBITRE SI FRMA I PRDTTI SUBSTRAT ED IIBITRE SI LEGA A SITI DIVERSI LA PRESEZA DELL IIBITRE RIDUCE LA VELCITÀ DI FRMAZIE DEL PRDTT v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Inibitori acompetitivi Agiscono legandosi e bloccando il complesso enzima-substrato. E + S ES + I E + P = K i K i = [E] [ES] [I][ES] [ESI] ESI v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
58 Inibitori acompetitivi Senza inibitore v = + Con inibitore v v = [I] ( 1 + ) K i [I] ( 1 + ) + K i v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Inibitori acompetitivi Senza inibitore 1/V 1 v K = M / Con inibitore -1/(app) 0 1/ 1 v K = M 1 1 [I] + ( 1 + ) K i v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
59 Riassumendo Inibizione competitiva K i E + S + I ES E + P = K i = [E] [ES] [I][E] [EI] Inibizione non competitiva EI + S E + S + I K i ES + I K i ' E + P K i ' = [I][ES] [ESI] EI + S ESI Inibizione acompetitiva E + S ES + I K i ' E + P ESI v gsartor B06 - Cinetica enzimatica riassumendo [I] a = (1 + ) K i [I] a' = (1 + ) K i ' Tipo di inibizione V MAX app app essuna V MAX Competitiva on competitiva Acompetitiva V MAX V MAX /a V MAX /a a a /a /a v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
60 Inibitori irreversibili Inibitore Formula rigine Meccanismo Ione cianuro C - Mandorle amare Complessa gli ioni metallici nelle proteine Diisopropil fluorofosfato (DFP) 3 C C 3 F C 3 P C 3 Sintetico Inibisce gli enzimi con serina nel sito attivo Sarin 3 C C 3 F P C 3 Sintetico Come il DFP Fisostigmina 3 C 3 C C 3 Frutto del calabar Come il DFP C 3 v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Inibitori irreversibili Inibitore Formula rigine Meccanismo Parathion C C 2 5 P S Sintetico Come il DFP (particolarmente attivo su acetilcolinesterasi di insetti) -tosil-lfenilalanina clorometil chetone (TPCK) S Cl Sintetico Reagisce con l is- 57 della chimotripsina R Penicillina S C 3 C 3 C 3 Penicillum otatum Inibisce gli enzimi della sintesi della parete batterica v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
61 Attivatori Sono molecole che aumentano (o permettono) l attività enzimatica Protezione dell enzima Glutatione Ioni metallici Attivazione per azione sulle subunità Enzima inattivo + camp Subunità + Subunità catalitica regolatrice Azione proteolitica su proenzimi v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Attivatori Azione proteolitica su proenzimi Tripsinogeno + Tripsina Enteropeptidasi Chimotripsinogeno + Proelastasi Elastasi + Procarbossipeptidasi + Carbossipeptidasi π-chimotripsina + α-chimotripsina v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
62 Effetti allosterici Un enzima allosterico è, in genere, un oligomero con subunità correlate. Gli effetti allosterici consistono nel legame di un effettore ad un sito diverso da quello del substrato con conseguente variazione delle proprietà cinetiche dell enzima. L effettore può essere lo stesso substrato (effettori omotropici) o diverso (effettori eterotropici). Sito attivo Sito dell effettore v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Effetto allosterico Un enzima allosterico è un oligomero con subunità correlate la cui attività (K m ) viene influenzate dal legame del substrato v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
63 Effetti allosterici Il legame con l effettore modifica (modula) le proprietà di legame del substrato. La velocità dipende da come una sigmoide. v v = n K + n n = indice di cooperatività (costante di ill) n = 1 nessuna cooperatività n > 1 cooperatività positiva n < 1 cooperatività negativa v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Effetti allosterici Il legame con l effettore modifica (modula) le proprietà di legame del substrato. La velocità dipende da come una sigmoide. v v = n K + n n = indice di cooperatività Emoglobina v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
64 Vie metaboliche Una via metabolica è data da un insieme di reazioni catalizzate da enzimi che si susseguono l una all altra. Le vie metaboliche sono regolate: Inibizione da prodotto A B C D E Attivazione da substrato A B C D E Attivazione compensatoria A B C D E K X Y Z P v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Vie metaboliche ramificate Inibizione multivalente A B C D E F G K X Y Inibizione cooperativa A B C D E F G K X Y v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
65 Vie metaboliche ramificate Inibizione cumulativa A B C D E F G K I Z X Y Inibizione di enzimi multipli A B C D E F G K X Y v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Catabolismo e anabolismo C S A B E F T Z X Y v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
66 Regolazione genica Un altra via con la quale viene regolata l attività di uno o più enzimi è attraverso l induzione o la repressione genica della sintesi proteica di quella proteina con attività enzimatica. Anche per gli enzimi esiste una sorta di omeostasi. EZIMA mra SITESI DEMLIZIE AMIACIDI Induzione Repressione DA v gsartor B06 - Cinetica enzimatica Regolazione genica Un altra via con la quale viene regolata l attività di uno o più enzimi è attraverso l induzione o la repressione genica della sintesi proteica di quella proteina con attività enzimatica. Anche per gli enzimi esiste una sorta di omeostasi. EZIMA mra SITESI DEMLIZIE AMIACIDI Induzione Repressione DA v gsartor B06 - Cinetica enzimatica
67 Crediti e autorizzazioni all utilizzo Questo materiale è stato assemblato da informazioni raccolte dai seguenti testi di Biochimica: CAMPE Pamela, ARVEY Richard, FERRIER Denise R. LE BASI DELLA BICIMICA [ISB ] Zanichelli ELS David L., CX Michael M. I PRICIPI DI BICIMICA DI LEIGER -Zanichelli GARRETT Reginald., GRISAM Charles M. BICIMICA con aspetti molecolari della Biologia cellulare - Zanichelli VET Donald, VET Judith G, PRATT Charlotte W FDAMETI DI BICIMICA [ISB ] - Zanichelli E dalla consultazione di svariate risorse in rete, tra le quali: Kegg: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Brenda: Protein Data Bank: Rensselaer Polytechnic Institute: Il materiale è stato inoltre rivisto e corretto dalla Prof. Giancarla rlandini dell Università di Parma alla quale va il mio sentito ringraziamento. Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da: gsartor.org/pro Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l autore usando questa frase: Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor Università di Bologna Giorgio Sartor Ufficiale: giorgio.sartor@unibo.it Personale: giorgio.sartor@gmail.com Aggiornato il 07/03/ :15:52 67
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