v = Δ[P] = _ Δ[S] S P

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1 CINETICA ENZIMATICA Gli esperimenti di cinetica enzimatica si basano sulla determinazione della velocità di reazione, misurata come variazione della concentrazione del prodotto o del reagente in un dato intervallo di tempo. S P [P] = aumenta nel tempo [S]= diminuisce nel tempo v = Δ[P] = _ Δ[S] Δt Δt [S] [P] Col procedere della reazione le curve cinetiche si appiattiscono: la velocità non subisce variazioni. S è consumato perché trasformato in P e la reazione tenderà a raggiungere l equilibrio.

2 S P v = Δ[P] = _ Δ[S] Δt Δt [S] =5 mm [P] Problema: se miscelo un enzima con diverse concentrazioni di substrato (5, 10 o 20 mm, per es ), come varia la velocità della reazione alle diverse concentrazioni di substrato utilizzate? Tempo (min) [S] =20 mm [P] [S] =10 mm [P] Tempo (min) Tempo (min)

3 La velocità della reazione aumenta all aumentare della [S], ma per avere un valore preciso devo considerare la VELOCITA INIZIALE di reazione [S] [P] Devo misurare la velocità della reazione al MOMENTO INIZIALE (entro i primi sec), quando la quantità di prodotto formato è molto bassa e la concentrazione del substrato ha un valore preciso e noto (quello iniziale stabilito dallo sperimentatore). tempo In questo modo posso associare al valore di [S] utilizzata un dato valore di V 0 (velocità iniziale)

4 COME DETERMINO LA VELOCITA INIZIALE? Studio di una reazione enzimatica semplice (1 solo substrato e 1 solo stadio intermedio): 1) miscelo l enzima con il suo substrato, lavoro a temperatura e ph costanti, 2) Preparo un certo numero di miscele di reazione in cui la [E] è inalterata, ma la [S] è diversa: per ogni esperimento misuro come varia la concentrazione del prodotto, che si forma nel tempo. Substrato [S] = 1 mm Prodotto enzima v = Δ[P] = _ Δ[S] Δt Δt [S] = 5 mm [S] = 2 mm Substrato [S] = 2 mm [S] = 1 mm Substrato [S] = 5 mm

5 3) La velocità di reazione aumenta all aumentare della concentrazione del substrato utilizzata come in una reazione di 1 ordine. v = Δ[P] = _ Δ[S] Δt Δt v = k [S] -1/Δt = k (costante di velocità specifica per ogni reazione) -Reazione di 1 ordine- v = Δ[P] = _ Δ[S] Δt Δt

6 4) Calcolo il valore della velocità di reazione iniziale (v 0 ) alle diverse [S]. VELOCITA INIZIALE (v 0 ) è calcolata come pendenza della tangente alla curva cinetica. Per ognuna delle curve cinetiche ottenute a diverse [S] viene calcolata la v 0 (4) v 0 (3) v 0 (2) v 0 (1) Ogni punto rappresenta un diverso esperimento, ed è definito da due parametri: v 0 e [S] - La v 0 aumenta all aumentare della concentrazione di reagente [Substrato] usata per la reazione. - La dipendenza di v 0 dalla [S] è descritta da una curva iperbolica (Modello cinetico di Micaelis-Menten)

7 Leonor Micaelis Maud Menten

8 ENZIMI CHE SEGUONO IL MODELLO CINETICO DI MICHAELIS-MENTEN Mostrano una dipendenza della velocità iniziale (v 0 ) dalla concentrazione di substrato di tipo IPERBOLICO. Catalizzano una reazione enzimatica che nel caso più semplice prevede: 1 prima tappa veloce e reversibile (ΔG minore e k maggiore) S + E k 1 k -1 ES 1 seconda tappa lenta e irreversibile (ΔG maggiore e k minore) che determina la velocità globale di reazione ES k 2 k -2 E + P k 1 = cost cinetica reazione di formazione del complesso ES k -1 = cost cinetica reazione di decomposizione del complesso ES in E + S k 2 = cost cinetica reazione di decomposizione del complesso ES in E + P k -2 = talmente piccola da essere trascurabile

9 Velocità iniziale v 0 (μm/min) Inserendo in un grafico i valori di v 0 ottenuti per le diverse [S] utilizzate ottengo una curva iperbolica Alte [S] = la v 0 non varia molto al variare di [S], l enzima è quasi completamente saturato, viene raggiunta asintoticamente una velocità di reazione massima. La v 0 non dipende più da [S]. Basse [S] = la velocità di reazione v 0 dipende strettamente dalla [S], aumenta all aumentare della [S] Concentrazione substrato [S] (mm) Posso spiegare questo comportamento con un equazione che correla la v 0 alla [S], alla Vmax e ad una costante di affinità (Km)

10 v = k 1 [E] [S] v = k 2 [ES] 1a tappa: Passaggio rapido k 1 k 2 S + E ES E + P k -1 2a tappa: Passaggio lento v = k -1 [ES] La v 0 GLOBALE della reazione enzimatica dipende da [ES] Questa equazione non è sufficiente a spiegare la relazione iperbolica esistente tra v 0 e [S]. v 0 = k 2 [ES] [ES] = non è facilmente misurabile, e k 2 non è nota Bisogna ricavare un equazione alternativa partendo dalla considerazione che la [ES] rimane costante nel tempo della reazione, e che la 1a tappa della reazione enzimatica raggiunge rapidamente lo STATO STAZIONARIO k 1 S + E ES k -1

11 COMPLESSIVAMENTE [ES] RIMANE COSTANTE NEL TEMPO La concentrazione dell enzima libero [E] in soluzione diminuisce man mano che va a formare il complesso [ES]. Ma poiché il complesso ES è demolito continuamente (in E + S o in E + P), l ENZIMA è di nuovo reso libero. STATO STAZIONARIO

12 [ES] rimane costante: la velocità della sua formazione è uguale alla velocità della sua demolizione Velocità di Formazione di ES (E + S ES): V = k 1 [E] [S] = k 1 ([E] TOT [ES]) [S] k 1 k 2 S + E ES k E + P -1 k -1 k 2 Velocità di Demolizione di ES (ES S + E..ES P + E): V = k -1 [ES] + k 2 [ES] [E] = [E] TOT [ES] poiché la concentrazione TOTALE di Enzima è [E] TOT = [E] + [ES] Se è raggiunto lo stato stazionario posso dire che: V formazione ES = V demolizione ES k 1 ([E] TOT [ES]) [S] = k -1 [ES] + k 2 [ES] Riarrangiando l equazione tramite operazioni algebriche si ottiene che: ([E] TOT [ES]) [S] = ( k -1 + k 2 ) k -1 + k 2 [ES] k 1 K m = k 1 Costante di Michaelis-Menten

13 K m = k -1 + k 2 k 1 Costante di Michaelis-Menten Il rapporto fra le costanti cinetiche della dissociazione di ES e quella della sua formazione è uguale alla COSTANTE DI DISSOCIAZIONE DEL COMPLESSO ES Semplificando i termini dell equazione precedente si ottiene che: ([E] TOT [ES]) [S] = Km [ES] [E] TOT [S] [ES][S] = [ES] Km [ES] Km = [E] TOT [S] [ES][S] [ES] Km + [ES][S] = [E] TOT [S] [ES] (Km +[S]) = [E] TOT [S] [ES] = [E] TOT [S] [S] + K m

14 Poiché la v 0 globale di reazione è : v 0 = k 2 [ES] e quindi: [ES] = v 0 / k 2 [ES] = [E] TOT [S] [S] + K m k 2 [E] TOT = Vmax v 0 = k 2 [E] TOT [S] [S] + K m Introduciamo un altro parametro importante: la Velocità massima di reazione. Quando sono presenti nella miscela di reazione concentrazioni saturanti di substrato, allora, tutto l enzima è complessato col substrato e la [E] TOT = [ES] La velocità globale di reazione non dipende più dalla concentrazione di substrato, ma solo dalla concentrazione totale dell enzima: v 0 = k 2 [ES] diventa Vmax = k 2 [E] TOT

15 v 0 (μm/min) Equazione di Michaelis-Menten v 0 = Vmax [S] Km + [S] La velocità iniziale della reazione enzimatica dipende dalla [S] in modo iperbolico ed è correlata alla Vmax (= k 2 [E] tot ) e alla Km Il valore della Km si può determinare sperimentalmente = Corrisponde alla [S] alla quale raggiungo la metà della Vmax. Ha le unità di misura di una concentrazione k 1 k 2 S + E ES E + P k -1 [S] (mm) v 0 = ½ Vmax = Vmax [S] [S] + Km 1 [S] = 2 [S] + Km Km + [S] = 2 [S] Km = [S] Solo se v 0 = ½ Vmax

16 Km = k -1 + k 2 k 1 (k 2 << k -1 = trascurabile) La Km è uguale alla costante di dissociazione del complesso ES Km = La Km fornisce informazioni sull affinità che un enzima ha nei confronti del suo substrato ed è SPECIFICA per ogni diverso enzima nei confronti di un dato substrato. Più è grande, minore sarà l affinità dell enzima per il substrato (maggiore sarà la costante di dissociazione del complesso ES, k -1 > k 1 ) Più è piccola maggiore sarà l affinità (minore la costante di dissociazione di ES, k 1 > k -1 ) Considerazioni valide per reazioni enzimatiche semplici a due tappe e in cui k 2 << k -1, non per tutti gli enzimi, molte reazioni enzimatiche sono a più tappe e la Km diventa una funzione più complessa che dipende da varie costanti cinetiche. k -1 k 1

17 La Km fornisce informazioni sulla efficienza della catalisi e sul controllo della velocità se [S] >> 10 Km concentrazioni saturanti di substrato, la reazione è molto efficiente perché quasi a Vmax, ma non controllabile variando la [S] se [S] << 0.1 Km concentrazioni bassissime di substrato, la reazione non è efficiente ma la si può controllare variando [S], poiché la v 0 aumenta all aumentare della [S]. [S] >> 10 Km Nelle cellule [S] Km le reazione metaboliche sono regolabili variando [S] [S] << 0.1 Km Berg et al., BIOCHIMICA 6/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2007

18 v 0 (μm/min) 1 enzima 2 substrati simili A e B medesime condizioni di reazione Verso quale dei due l enzima è più affine? A A B ½ Vmax Km A Km B [S] mm

19 Costante catalitica o n di Turnover k 1 k 2 S + E ES E + P k -1 Vmax = k 2 [ES] = k 2 [E] TOT k Vmax 2 = [E] TOT k 2 per una reazione semplice ad uno stadio corrisponde alla k cat (costante catalitica) Indica il numero di eventi catalitici che avvengono nel sito attivo dell enzima nell unità di tempo (le sue unità di misura sono s -1 o min -1 ). Misura quanto velocemente un dato enzima può catalizzare una data reazione. E SPECIFICA per ogni enzima. Problema: Esperimento 1. [S] = saturante [E] = mm Esperimento 2. [S] = saturante [E] = 0.05 mm Che differenza c è fra i due esperimenti in termini di Vmax e Km?

20 v 0 (μm/sec) A [S] saturante la v 0 raggiunge il suo valore massimo (Vmax), non può più variare in funzione della concentrazione di substrato, perché tutto l enzima presente è saturato. Se raddoppio la concentrazione dell enzima raddoppia la Vmax. Vmax = k 2 [E] tot Vmax B = k 2 [E] B [E] B = 0.05 mm LA Km RIMANE INVARIATA Vmax A = k 2 [E] A [E] = mm Km [S] mm

21 EFFICIENZA CATALITICA DI UN ENZIMA Parametro che utilizziamo per confrontare l efficienza catalitica e la specificità di enzimi diversi per uno stesso substrato o di uno stesso enzima per substrati diversi. Costante di specificità: k cat /Km (M -1 sec -1 ) Kcat più alta per la CO 2 = specificità maggiore ENZIMA SUBSTRATO kcat (sec -1 ) Km (M) kcat/km (M -1 sec -1 ) Acetilcolinesterasi Acetilcolina 1.4x10 4 9x x10 8 Anidrasi carbonica CO 2 1x x x10 7 Anidrasi carbonica HCO 3-4x x x10 7 Catalasi H 2 O 1.4x10 4 9x x10 8 Fumarasi Fumarato 8x10 2 5x x10 8 Fumarasi Malato 9x x x10 7 Km più bassa per il fumarato= specificità maggiore