MODULO 2 ENZIMI CARATTERISTICHE GENERALI

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1 MODULO 2 ENZIMI CARATTERISTICHE GENERALI Introduzione L elevatissimo numero di reazioni chimiche, che in ogni istante avvengono all interno e all esterno delle cellule che costituiscono i nostri tessuti e quelli di tutti gli esseri viventi, non potrebbero avere luogo alle condizioni di temperatura, pressione e ph fisiologici, se non esistessero gli enzimi. Gli enzimi sono biocatalizzatori, ovvero proteine che hanno lo specifico compito di accelerare le trasformazioni chimiche. Questa loro proprietà li rende fulcro principale dei meccanismi che regolano i diversi percorsi metabolici. Lo studio degli enzimi ha quindi un importanza notevole per la comprensione dei processi biochimici che stanno alla base della vita. Al tempo stesso deficienze funzionali o quantitative di enzimi sono spesso causa di stati patologici. Ne consegue che il loro dosaggio in campioni biologici, quali plasma o biopsie tessutali, è frequentemente un ausilio diagnostico fondamentale. Infine è importante ricordare che l azione di numerosissimi farmaci si esplica attraverso l interazione con enzimi. Obiettivi In questa unità verranno presentate: le proprietà generali degli enzimi, la rilevanza degli enzimi in medicina. Classificazione Nell uomo e nella maggior parte degli organismi viventi avvengono in ogni istante numerosissime reazioni chimiche che possono procedere ad una velocità biologicamente significativa (ovvero compatibile con la vita) solo grazie alla presenza di catalizzatori biologici denominati enzimi.

2 Si tratta, nella maggior parte dei casi, di molecole di natura proteica dotate di potere catalitico, ovvero capaci di aumentare la velocità di reazione delle trasformazioni chimiche, senza subire modificazioni. Al termine della trasformazione l enzima si ritrova immutato rispetto alle condizioni di partenza e pronto per ripetere la propria funzione. Tale attività dipende dalla conformazione proteica dell'enzima e si caratterizza per l elevata specificità nei confronti del substrato e della reazione catalizzata. Attraverso la regolazione dell attività enzimatica le cellule, i tessuti e gli organismi decidono quali reazioni debbano avvenire o quanto velocemente debbano procedere. Il crescente numero degli enzimi conosciuti ha reso necessaria l introduzione di una nomenclatura e di una classificazione sistematica, in sostituzione di quella tradizionale. Questa generalmente attribuiva a ciascun enzima un nome basato sulla natura del substrato e del processo chimico catalizzato, utilizzando il suffisso -asi (es.: lattato deidrogenasi o glucosio ossidasi). La commissione per gli Enzimi (EC) dell Unione Internazionale di Biochimica ha distinto gli enzimi in sei classi principali, poi suddivise ulteriormente in sottoclassi e sottosottoclassi in base al tipo di reazione catalizzata. Distinguiamo così: (1) le ossidoreduttasi, che catalizzano il trasferimento di equivalenti riducenti tra due coppie redox, (2) le trasferasi, per il trasferimento di gruppi di atomi da un donatore ad un accettore, (3) le idrolasi, per il trasferimento di gruppi all acqua, (4) le liasi, che catalizzano la scissione o formazione di legami chimici (spesso doppi), (5) le isomerasi, che mediano l interconversione di isomeri come CIS <- -> TRANS o L <- -> D, (6) le ligasi, che mediano reazioni di condensazione tra due molecole con accoppiata l idrolisi di ATP o di un trifosfato simile. Gli enzimi catalizzano reazioni chimiche in cui una o più molecole, dette substrato/i, vengono trasformate in altre molecole, dette prodotto/i. Molto spesso l attività degli enzimi dipende dalla presenza di componenti chimici addizionali chiamati cofattori; può trattarsi di ioni inorganici quali Fe 2+, Mg 2+ o Zn 2+ oppure di molecole più complesse e di natura organica, più propriamente definite coenzimi. Quando tali cofattori o coenzimi sono legati stabilmente all enzima vengono anche definiti gruppi prostetici. Nel caso di enzimi coniugati a cofattori/coenzimi, il termine di apoenzima definisce la porzione proteica dell enzima stesso, mentre quello di oloenzima indica il complesso funzionale nella sua completezza.

3 Coenzimi I coenzimi sono molecole importanti ed essenziali per l attività di molti enzimi, specie di quelli che catalizzano il trasferimento di elettroni o gruppi di atomi da una molecola all altra. I coenzimi sono molecole organiche, spesso derivate da vitamine del gruppo B o dall adenosinmonofosfato (AMP), che partecipano attivamente alle trasformazioni chimiche catalizzate dall enzima. A differenza dell enzima, che rimane immutato al termine della reazione chimica, il coenzima può essere considerato un secondo substrato che subisce trasformazioni opposte a quelle del substrato principale. Per esempio, nella catalisi di una reazione di ossidoriduzione, quando una molecola di substrato viene ossidata, una molecola di coenzima viene ridotta. Oppure, nelle reazioni di trasferimento di gruppi funzionali, il coenzima può fungere da accettore finale o da trasportatore intermedio. Le modifiche subite dal coenzima nel corso di una reazione chimica fanno sì che esso non possa essere disponibile per una nuova reazione senza essere prima riportato (attraverso altre reazioni chimiche) allo stato iniziale. L Interazione enzima-substrato Specificità Le caratteristiche fondamentali degli enzimi sono quelle di poter esercitare un attività catalitica, con specificità elevata per reagenti e prodotti. Punto essenziale dell omeostasi cellulare è il fatto che l attività enzimatica può essere sottoposta a regolazioni estremamente fini e puntuali. L azione catalitica (potere catalitico) degli enzimi si esplica attraverso la creazione di un microambiente specifico in cui una determinata reazione risulta essere energicamente favorita. Alla base di tale fenomeno sta l interazione diretta e specifica tra substrato/i ed enzima, più eventuali coenzimi. La porzione della molecola enzimatica che media il riconoscimento specifico del substrato viene definita sito attivo o sito di legame del substrato.

4 Esso occupa una parte relativamente piccola della molecola enzimatica ed è generalmente una sorta di cavità o fenditura in cui si adatta il substrato. La superficie di questa sorta di tasca è rivestita da residui aminoacidici che derivano da parti diverse e solitamente non consecutive della struttura primaria della proteina. Tali residui partecipano con i loro atomi e gruppi funzionali all interazione con il substrato e/o alla formazione/rottura di legami chimici; sono perciò detti gruppi catalitici. Complementarietà E/S Il riconoscimento enzima/substrato con formazione del complesso ES (enzima/substrato) è mediato da attrazioni deboli, quali le interazioni elettrostatiche, legami idrogeno, forze di Van der Waals e interazioni idrofobiche.

5 Solo una perfetta complementarietà tra substrato e sito attivo fa sì che il numero di tali interazioni sia elevato e determini una significativa stabilità del complesso ES. Da ciò deriva l assoluta specificità dell interazione tra i due componenti e del tipo di trasformazione che si realizza. Tale specificità è così elevata che anche gli stereoisomeri sono discriminati dagli enzimi. Per esempio, gli enzimi della glicolisi riconoscono come substrati i D-fosfozuccheri, ma non gli L-fosfozuccheri. Modello chiave serratura Un enzima è quindi caratterizzato da un assoluta specificità di reagente e di reazione. Il modello della chiave e della serratura descrive visivamente la specificità dell interazione tra sito attivo (serratura) e reagente (chiave).

6 Tale modello prevede l esistenza di una perfetta complementarietà tra le due componenti anche quando sono fisicamente separate l una dall altra. Modello adattamento indotto Una rappresentazione alternativa che meglio descrive la realtà dinamica di alcuni complessi ES è quella che prevede un adattamento reciproco delle due componenti in gioco. Tale modello (adattamento indotto) prevede che, dopo un primo riconoscimento più debole, l interazione possa essere rafforzata per intensità e specificità tramite minimi spostamenti di alcuni atomi costituenti il sito attivo dell enzima e la porzione interagente del substrato, con conseguente cambiamento della forma complessiva dei due componenti e raggiungimento della perfetta complementarietà. Come ben illustrato nella figura successiva, il modello chiave serratura prevede che sito di riconoscimento del substrato sull enzima e substrato (o parte di esso) corrispondano perfettamente l uno all altro; al contrario, nel modello dell adattamento indotto, la complementarietà tra i due componenti è inizialmente

7 approssimativa; l interazione iniziale innesca un processo di adeguamento complementare che ottimizza l unione tra enzima e substrato. Enzimi e medicina Lo studio e l analisi quantitativa di alcuni enzimi plasmatici ha un ruolo diagnostico importante in medicina. Il plasma contiene normalmente alcuni enzimi e proenzimi intrinseci, che svolgono la loro azione fisiologica nel sangue. Un esempio classico di tale tipologia di enzimi è rappresentato dai fattori coinvolti nella coagulazione. Nel plasma, in condizioni normali, si riscontrano tuttavia anche bassi livelli di enzimi estrinseci (non funzionali), che non svolgono in tale sede la loro attività fisiologica; sono enzimi rilasciati dalle cellule morte nel corso del normale processo di ricambio cellulare a carico di vari organi e tessuti. Quando stati patologici si associano a danno tissutale ed aumentata morte cellulare, gli enzimi cellulari solubili liberati dalle cellule necrotiche si riversano nel circolo ematico; il loro dosaggio può essere un presidio diagnostico/prognostico importante, in quanto concentrazioni superiori alla norma indicano la presenza di sofferenza tissutale e spesso, data la distribuzione tessuto-specifica di molti tipi di enzimi o isoenzimi, consentono l identificazione dell organo sofferente. La conoscenza della normale distribuzione tissutale di molti enzimi, consente quindi di utilizzare il dosaggio degli enzimi plasmatici per monitorare le condizioni di salute di molti organi. La figura seguente mostra un elenco di enzimi sierici utilizzati in diagnostica clinica. Enzimi e diagnostica Il dosaggio di alcuni enzimi sierici ha raggiunto rilevanza notevolissima nello studio dell infarto cardiaco. Monitorando nel tempo le concentrazioni sieriche di enzimi quali la creatin fosfochinasi (CPK) e la lattato

8 deidrogenasi (LDH) si ottengono informazioni importanti per la diagnosi differenziale, la terapia, e la prognosi dell infarto cardiaco. Già poche ore dopo l infarto miocardio si riscontra un incremento significativo di CPK, con valori massimi raggiunti generalmente entro ore. Il monotoraggio dell enzima CPK è un test veloce e dotato di discreta specificità (aumenti della concentrazione si riscontrano anche nelle patologie muscolari), che può essere notevolmente incrementata valutando l isoenzima miocardio, definito CPK-MB. L attività dell enzima LDH nel siero aumenta sensibilmente dopo circa ore dall episodio acuto. Anche in questo caso la specificià del saggio viene considerevolmente incrementata monitorando l isoenzima LDH1 o il rapporto tra le concentrazioni di LDH1 e LDH2. Isoenzimi e medicina Lo studio degli isoenzimi ha risvolti molto importanti in medicina, visto che alcuni di essi sono identificabili e quantificabili nel siero umano (enzimi estrinseci) e il loro dosaggio fornisce informazioni diagnostiche tessuto-specifiche. Un esempio significativo è quello della LATTATO DEIDROGENASI. Tale enzima è un complesso multimerico, formato da 4 subunità, di due tipi diversi: la subunità H e la subunità M. La diversa combinazione delle subunità crea 5 isoenzimi diversi, che differiscono quindi per la loro struttura quaternaria. Essi sono: HHHH, HHHM, HHMM, HMMM, MMMM. L abbondanza relativa di diversi isoenzimi differisce da organo ad organo; per esempio il cuore presenta elevati livelli dell isoenzima 1 (HHHH), mentre il fegato esprime abbondantemente l isoenzima 5 (MMMM). Analizzando i livelli sierici specifici di ciascuna isoforma, si possono quindi ottenere informazioni importanti sulla presenza di danni epatici o cardiaci. La figura mostra i risultati di tale indagine in tre condizioni diverse.

9 Riepilogo Gli enzimi sono proteine con funzione catalitica che regolano la velocità delle trasformazioni chimiche che sottendono i processi fisiologici. In relazione al tipo di reazione catalizzata sono distinti in sei classi principali: ossidoreduttasi, transferasi, idrolasi liasi, isomerasi ligasi. Spesso sono pienamente attivi solo in presenza di cofattori (ioni metallici) o coenzimi (molecole organiche). I coenzimi, a differenza degli enzimi, sono spesso modificati nel corso della reazione chimica. Gli enzimi si caratterizzano per una elevata specificità di substrato e reazione: interagiscono con un reagente specifico e ne catalizzano una specifica trasformazione. Nei diversi tessuti di un organismo possono esistere enzimi che, pur catalizzando la medesima reazione chimica, differiscono per alcune proprietà fisiche: questi sono detti isoenzimi. Il dosaggio di enzimi e isoenzimi nei campioni biologici può fornire informazioni diagnostiche importanti.

10 CINETICA ENZIMATICA Introduzione Gli enzimi sono biocatalizzatori, ovvero proteine che hanno lo specifico compito di accelerare le trasformazioni chimiche. Le caratteristiche cinetiche di una reazione chimica catalizzata da un enzima rispecchiano in buona parte quelle delle normali reazioni chimiche e sono riconducibili alla teoria della velocità delle reazioni. Gli enzimi aumentano la velocità di reazione consentendo la trasformazione dei reagenti in prodotti attraverso un percorso alternativo rispetto a quello che avverrebbe in assenza di enzima. Lo stato di transizione di questo percorso alternativo è caratterizzato da un energia di attivazione inferiore. Viene così aumentata la velocità di trasformazione, senza che si determini, in realtà, alcun effetto sull equilibrio finale della reazione. Fattori diversi possono influenzare la cinetica enzimatica come: la temperatura, il ph, le concentrazioni di enzima e substrato, la presenza di inibitori. Obiettivi I punti basilari di questa lezione saranno: il richiamo agli aspetti fondamentali della cinetica chimica, la modalità della catalisi enzimatica, i fattori che influenzano la cinetica enzimatica, i concetti di K m e velocità massima, l inibizione enzimatica e la sua rilevanza in medicina. Cinetica chimica: equilibrio e velocità di reazione Cinetica chimica: Δ G, equilibrio e spontaneità di reazione Le reazioni chimiche sono per la maggior parte processi reversibili; se i reagenti A e B si combinano a formare il prodotto AB, quest ultimo, nelle stesse condizioni, può dissociarsi per dare A e B. Partendo da condizioni iniziali diverse (diverse concentrazioni di A e B) si raggiungerà comunque uno stadio finale di equilibrio dinamico in cui la velocità di formazione di AB sarà pari a quella di scissione di AB in A e B. La direzione in cui la reazione tende a procedere e le concentrazioni di reagenti e prodotti al raggiungimento dell equilibrio finale sono determinate dalla differenza di energia libera tra i prodotti e i reagenti. Questo parametro termodinamico è denominato variazione di energia libera (Δ G e Δ G in condizioni standard biologiche). Quando Δ G è negativo, ovvero i prodotti hanno energia libera inferiore a quella dei reagenti, la reazione tende a procedere verso i prodotti. Al contrario, se Δ G è positivo sarà favorita la direzione opposta. Esiste una correlazione diretta tra Δ G e costante d equilibrio tale per cui: Δ G = -RT ln Keq. Cinetica chimica: stato di transizione e velocità di reazione La variazione di energia libera indica in che direzione tende a procedere spontaneamente la reazione fino all equilibrio, ma non fornisce informazioni sulla velocità con cui tale equilibrio viene raggiunto.

11 Molte reazioni, pur possedendo Δ G altamente favorevoli, decorrono con estrema lentezza. La velocità con cui una reazione chimica procede dipende invece dalle sue caratteristiche cinetiche, e in particolar modo da un parametro indicato con il termine di energia di attivazione. Con essa si indica una barriera energetica che esiste tra reagenti e prodotti e che corrisponde all energia necessaria ad allineare i gruppi reagenti, a formare cariche transitorie instabili, ad allentare legami esistenti e formarne parzialmente di nuovi, in modo che la trasformazione chimica possa avvenire. Questa barriera energetica, definita energia di attivazione, corrisponde all energia necessaria per il raggiungimento di uno stato di transizione tra reagenti e prodotti. Quanto maggiore è l energia di attivazione tanto minore è la velocità di reazione.

12 La teoria delle collisioni Secondo la teoria delle collisioni, affinché due reagenti possano trasformarsi in prodotti essi devono collidere. Solo una parte delle collisioni è efficace ai fini della reazione chimica, quelle in cui le molecole reagenti hanno un energia cinetica sufficiente a far superare la barriera di attivazione e a generare lo stato di transizione. Aumentando la temperatura si aumenta l energia cinetica delle molecole e quindi si aumenta la velocità di reazione; risultato analogo si ottiene aumentando la concentrazione dei reagenti, in quanto si rendono più probabili le collisioni tra molecole, tra queste anche quelle produttive. Enzimi: i catalizzatori biologici La velocità di una reazione chimica può essere aumentata dall intervento di catalizzatori, ed in particolar modo di enzimi. Gli enzimi consentono una maggiore velocità di reazione rendendo possibile un percorso alternativo per la trasformazione dei reagenti in prodotti. Tale percorso è caratterizzato da uno o più stati di transizione con un energia di attivazione inferiore rispetto a quello in condizioni basali.

13 Questo fa sì che in presenza di un enzima l equilibrio della reazione venga raggiunto molto più velocemente, senza che vengano però mutate le sue caratteristiche; la Keq non cambia. Infatti l enzima si ritrova inalterato alla fine della reazione e quindi non ha effetto sulla variazione globale di Δ G, che dipende esclusivamente dallo stato iniziale e finale delle molecole coinvolte nella reazione. L effetto di un enzima sulla velocità di reazione è spesso rimarchevole, con incrementi che possono andare da 5 a 17 ordini di grandezza.

14 Azione catalitica L azione catalitica degli enzimi si realizza attraverso l interazione diretta con il substrato a livello del sito attivo. Tale interazione dà luogo a fenomeni che consentono di spiegare come la presenza dell enzima possa accelerare la reazione. Considerando per esempio la reazione bimolecolare A + B -> C è intuitivo comprendere che l alloggiamento dei substrati (A e B) nel sito attivo determina un incremento della loro concentrazione locale rispetto a quella esistente nella soluzione in assenza di enzima. A tale effetto di prossimità tra i reagenti, si aggiunge un effetto di orientazione. L enzima facilita quindi l incontro produttivo tra i substrati vincolandoli nel sito attivo, impedendone i movimenti traslazionali e rotazionali ed affrontando opportunamente tra loro le parti/superfici coinvolte nella trasformazione.

15 Tensione di deformazione Secondo il modello dell adattamento indotto, l interazione enzima/substrato comporta inoltre una tensione di deformazione in entrambi i componenti: l enzima va incontro al riallineamento di alcuni residui aminoacidici (specie nel sito attivo) in modo che il loro orientamento spaziale divenga ottimale per il legame del substrato e per la catalisi.

16 A sua volta, il substrato va incontro a modifiche conformazionali e assume le caratteristiche dello stato di transizione. L energia libera rilasciata dalla serie di interazioni deboli che determinano la formazione del complesso ES consente la riduzione dell energia di attivazione necessaria per il raggiungimento dello stato di transizione. Il sito attivo dell enzima, mediante l energia di legame liberata nell interazione con il substrato, determina sia il potere catalitico che la specificità dell enzima stesso. Fattori che influenzano la cinetica enzimatica Temperatura: Come per le reazioni che avvengono in assenza di enzima, anche per quelle catalizzate da enzimi l incremento di temperatura, aumentando l energia cinetica delle molecole reagenti, comporta una maggiore velocità di reazione. Tuttavia, in presenza di enzima, l innalzamento progressivo della temperatura provoca ad un certo punto la denaturazione dell enzima, ovvero la perdita della sua struttura tridimensionale, essenziale per la funzionalità della molecola. Quando questo avviene l attività catalitica risulta completamente annullata. E evidente che nell uomo (a differenza di altri organismi viventi) i cambiamenti di temperatura compatibili con la vita sono così limitati che poco incidono sulle sue reazioni chimiche, sia in assenza che in presenza di enzima. PH: Anche il ph è un parametro che può modificare la velocità di reazioni enzimatiche. La maggior parte degli enzimi presenta attività ottimale ad un valore di ph compreso tra 5 e 9 e lo scostamento verso valori estremi di acidità o basicità determina denaturazione o comunque alterazione della carica netta dell enzima, e in particolar modo dei gruppi del sito attivo, con conseguente perdita di attività.

17 La concentrazione dell'enzima: La velocità di una reazione chimica catalizzata da un enzima è generalmente proporzionale alla concentrazione dell enzima stesso. All interno delle cellule la concentrazione degli enzimi è notevolmente inferiore alla concentrazione dei substrati, e quindi piccole modifiche della quantità di enzima disponibile si riflettono significativamente sulla velocità di trasformazione dei substrati in prodotti. La concentrazione del substrato: In un sistema in vitro (in laboratorio) è facile osservare come la quantità di substrato [S], tenute costanti tutte le altre condizioni, sia in grado di influenzare la velocità delle reazioni enzimatiche. Ai fini sperimentali si misura la velocità iniziale (Vi) della reazione e si osserva come cambi al variare di [S]: come evidenziato dal grafico nella figura, Vi aumenta progressivamente al crescere di [S] fino al momento in cui si raggiunge un valore massimo (Vmax) che non risulta ulteriormente incrementabile da aggiunte di ulteriore S.

18 La curva del grafico (descrizione sperimentale) è descritta perfettamente dal modello di Michaelis-Menten (descrizione teorica), che prevede appunto la formazione di un complesso ES tra enzima e substrato seguita dalla rapida trasformazione in prodotto. L equazione che descrive tale modello è: Vi = Vmax [S] / K m +[S], in cui Vi e Vmax sono rispettivamente Velocità iniziale e massima della reazione, [S] indica la concentrazione del substrato e K m è una costante specifica di ciascun enzima, detta costante di Michaelis-Menten. L equazione ed il grafico ci mostrano che:

19 () quando [S] è molto bassa (numericamente trascurabile rispetto al valore di Km), vi è una proporzionalità diretta tra Vi e [S]: Vi = Vmax [S] / K m (Poiché Vmax e Km sono costanti specifiche di ciascun enzima possiamo scrivere Vi=K [S]) () quando [S] è molto alta (K m numericamente trascurabile rispetto a [S]), la Vi diviene uguale alla Vmax (non più influenzabile da incrementi di [S]): Vi = Vmax () quando [S] è uguale a K m, si ha che la Vi è uguale alla metà della Vmax: Vi = Vmax [S] / 2[S] = ½ Vmax (i valori di [S] al numeratore e denominatore si elidono) K m è quindi una costante che caratterizza ciascun enzima e che ha le dimensioni di una concentrazione molare. Per quanto detto al paragrafo precedente, corrisponde infatti alla concentrazione di substrato a cui la velocità iniziale è pari alla metà della velocità massima (Vi = ½ Vmax). I valori di Vmax e K m caratterizzano ciascun enzima e possono essere determinati sperimentalmente. Ai fini pratici tale procedura risulta molto più semplice descrivendo il variare di Vi al variare di [S] attraverso il grafico dei doppi reciproci di Lineweaver-Burk, che presenta appunto i reciproci di Vi (1/Vi) e di [S] (1/[S]) rispettivamente in ordinata ed ascissa.

20 Il grafico evidenzia come l intersezione della retta (che teoricamente si può ottenere dopo aver effettuato la misurazione di Vi a due diverse [S]) con l asse delle ascisse consente di calcolare il valore di K m (1/K m ); mentre l intersezione con l asse delle ordinate quello di Vmax (1/Vmax). Per la maggior parte degli enzimi il cui comportamento è descrivibile dall equazione di Michaelis-Menten, il reciproco di K m (1/K m ) è un indicazione dell affinità dell enzima per il substrato, ovvero di quanto efficace è il riconoscimento tra enzima e substrato. Non tutti gli enzimi mostrano la cinetica di saturazione descritta dall equazione di Michaelis-Menten. Per alcuni di essi la curva di saturazione di Vi rispetto a [S] non è iperbolica, bensì sigmoidale (che ha la forma di una s). Questo comportamento è tipico di enzimi che interagiscono in modo cooperativo con il substrato: l interazione con una molecola di S facilita e migliora l interazione con un ulteriore molecola. Per questi enzimi, chiamati enzimi allosterici, K m e Vmax non possono essere calcolati come descritto in precedenza. Per alcuni enzimi di questa natura, esistono molecole capaci di potenziarne l attività catalitica (attivatori allosterici) ed altre capaci di diminuirla (inibitori allosterici). Gli inibitori: Le reazioni catalizzate da enzimi possono essere rallentate o bloccate da inibitori enzimatici. Molti farmaci sono inibitori enzimatici. Gli inibitori possono essere: reversibili e irreversibili. I primi si possono dissociare dall enzima ripristinandone l attività, mentre i secondi legano covalentemente o modificano definitivamente alcune porzioni essenziali dell enzima alterandone la funzionalità; spesso vengono definiti veleni degli enzimi.

21 Gli inibitori reversibili possono essere distinti in competitivi e non competitivi in base alle loro modalità di interazione con l enzima. I metodi d analisi cinetica con cui si studiano gli enzimi (curva di saturazione dell enzima) consentono di distinguere questi due tipi di inibizione enzimatica. Un inibitore competitivo compete con il substrato per il legame con il sito attivo. Se l inibitore occupa il sito attivo blocca l accesso del substrato e rallenta/blocca il processo catalitico. Solitamente gli inibitori competitivi sono molto simili al substrato e ne mimano la capacità di interazione con il sito attivo. Essendo tuttavia l interazione inibitore/enzima reversibile, ne risulta che l inibizione può essere scalzata da un incremento della concentrazione del substrato. Il diagramma di Lineweaver-Burk evidenzia alcune caratteristiche fondamentali di tale inibizione: la Vmax della reazione non viene cambiata poiché, anche in presenza di un inibitore, si può incrementare [S] per ottenere la stessa Vmax. Si osserva invece una riduzione apparente dell affinità per il substrato (1/K m apparente < 1/K m ), poichè occorre un maggiore [S] per ottenere ½ di Vmax.

22 Un inibitore non competitivo si lega invece ad un sito diverso da quello che riconosce il substrato e riduce o blocca l attività dell enzima. Questo può legare normalmente il substrato (la K m dell enzima rimane quindi invariata), ma non può catalizzarne la trasformazione in prodotto; la Vmax della reazione è conseguentemente inferiore a quella ottenibile in assenza di enzima competitivo. Inibitori enzimatici come farmaci. Molti farmaci esplicano la propria azione in quanto inibitori enzimatici. Un esempio importante e famoso è il farmaco penicillina, un inibitore irreversibile di un enzima batterico (glicopeptide transferasi) essenziale per la sintesi della parte batterica.

23 La penicillina è strutturalmente simile al substrato di questo enzima (il peptide con due amino acidi D- alanina terminali) e si lega quindi al suo sito attivo. L interazione enzima/penicillina è tuttavia molto forte e forma un intermedio molto stabile e praticamente non scalzabile dal substrato reale. Per questo la penicillina è definita anche un substrato suicida, che bloccando irreversibilmente l enzima glicopeptide transferasi determina la morte di batteri in divisione. Riepilogo Gli enzimi modificano sensibilmente la velocità di reazione senza tuttavia modificare la variazione di energia libera e quindi l equilibrio della reazione stessa. La prima tappa della catalisi è la formazione del complesso ES, mediata dall interazione complementare tra sito attivo e substrato. Questo comporta un (1) aumento della concentrazione locale dei substrati, (2) il loro corretto orientamento ai fini della trasformazione, (3) una tensione di deformazione, che nell insieme portano alla riduzione dell energia di attivazione relativa allo stato di transizione. La temperatura, il ph, la concentrazione dell enzima e del substrato, la presenza di inibitori possono influenzare l attività catalitica degli enzimi. Il modello di Michaelis-Menten spiega le proprietà cinetiche di molti enzimi.

24 REGOLAZIONE E CONTROLLO DELL ATTIVITA ENZIMATICA Introduzione In questa lezione verrà affrontata un altra importante proprietà degli enzimi: la regolazione della loro attività catalitica. Poiché le reazioni chimiche del nostro organismo e degli esseri viventi in genere sono catalizzate da enzimi, la regolazione di questi ultimi è un processo fondamentale per stabilire quando e per quanto ciascuna reazione debba avvenire. Questo è un aspetto determinante dell omeostasi, ovvero del mantenimento di un equilibrio metabolico. Comprendere la regolazione enzimatica significa comprendere le dinamiche di regolazione di cellule normali, ma anche le disfunzioni regolatorie associate a stati patologici. Obiettivi Questa lezione ha come obiettivi la descrizione degli aspetti fondamentali della regolazione enzimatica. Saranno presentate le proprietà della regolazione passiva ed attiva e verranno approfonditi: (1) il controllo allosterico (2) il controllo mediante modifiche covalenti: la fosforilazione e la proteolisi parziale. La regolazione passiva Il mantenimento dell equilibrio metabolico (omeostasi), da parte delle cellule e dell organismo in toto, necessita della capacità di bilanciare e coordinare le reazioni metaboliche modulandone la velocità in base ai cambiamenti dell ambiente intra ed extracellulare. Diversi fattori possono influenzare l attività enzimatica: alcuni di questi sono intrinseci alla modalità di funzionamento degli enzimi stessi e all organizzazione cellulare basale, ovvero si innescano spontaneamente (passivamente) al variare delle condizioni basali; altri richiedono l intervento di meccanismi specifici ed altre molecole (modalità attiva). Tra i primi fattori rientra il dato che buona parte degli enzimi ha valori di K m vicini a quelle che sono le concentrazioni basali dei substrati all interno delle cellule. Ciò significa che, basalmente, gli enzimi funzionano ad una velocità pari ad ½ di quella massima, apparentemente uno svantaggio; ciò significa invece che, di fronte ad aumenti subitanei della quantità di substrato, l enzima può aumentare efficacemente la velocità di trasformazione in prodotto.

25 Come evidenzia il grafico, questo non sarebbe possibile se gli enzimi lavorassero costitutivamente a velocità prossime alla massima. Le semplici risposte cinetiche al variare della concentrazione del substrato rappresentano un importante meccanismo di regolazione passiva dell attività enzimatica. L'organizzazione dei flussi metabolici. Le reazioni chimiche delle cellule sono per lo più organizzate in catene metaboliche in cui il prodotto finale di una reazione diviene il reagente della reazione successiva. Dal punto degli equilibri, questo fa si che anche reazioni teoricamente reversibili (con Δ G vicini a zero) divengano irreversibili e quindi procedano in una sola direzione. Queste catene possono essere considerate quasi come un unica reazione il cui Δ G finale è la somma di tutti i Δ G delle singole reazioni. Essendo il flusso delle reazioni unidirezionale, la catena assume specificità funzionale ed il processo inverso dovrà prevedere altri meccanismi enzimatici. L intero flusso di metaboliti lungo una catena di questa natura può essere semplicemente controllato regolando una o più tappe specifiche, che divengono le tappe limitanti dell intero processo. Così come il flusso di acqua in una conduttura dipende dalla sezione del punto più stretto della conduttura stessa, il flusso di molecole lungo una catena metabolica dipende dalla velocità con cui procedono le reazioni più lente e quindi limitanti. Questo semplifica i meccanismi di regolazione perché consente di concentrarli su uno o due enzimi, piuttosto che su tutta una serie di proteine e reazioni diverse. La regolazione attiva Alle modifiche dell attività enzimatica che si innescano spontaneamente si aggiungono i meccanismi attivi di regolazione, che esercitano un ruolo fondamentale nel garantire l omeostasi cellulare e la capacità di adeguarsi a cambiamenti subitanei dell ambiente esterno. La capacità catalitica degli enzimi cellulari può essere attivamente influenzata tramite due diversi meccanismi generali: (1) modifiche della quantità di enzima disponibile, (2) variazioni dell efficienza intrinseca degli enzimi stessi.

26 La quantità totale di ciascun enzima presente nella cellula dipende dalla velocità con cui è sintetizzato e degradato. In molti casi, entrambi questi processi possono essere selettivamente incrementati o rallentati, determinando una variazione della concentrazione dell enzima e quindi della sua attività catalitica. Esistono molecole, spesso gli stessi substrati di reazioni enzimatiche, che sono in grado di indurre la sintesi di uno o più enzimi coinvolti nel loro metabolismo: si utilizza in questi casi il termine di induttore, ed inducibili sono gli enzimi la cui espressione viene così regolata. Si distinguono dagli enzimi costitutivi, le cui concentrazioni cellulari non dipendono dalla presenza di induttori. L esempio classico di enzima inducibile è la Gal-1, necessario per il metabolismo del galattosio nei lieviti: l enzima viene prodotto solo in presenza di galattosio nel terreno di coltura. L induzione enzimatica è un processo che avviene anche nelle cellule di mammifero. Esiste inoltre anche la possibilità opposta: un metabolita appena prodotto da una via enzimatica agisca da repressore nei confronti di uno o più enzimi della stessa via metabolica bloccando quindi l ulteriore sintesi. Questo meccanismo viene anche definito repressione retrograda da prodotto. Entrambi i meccanismi si esplicano attraverso la regolazione dei processi trascrizionali o traduzionali di specifici enzimi. Se la regolazione dell espressione e quindi della sintesi enzimatica è un meccanismo di regolazione ben noto e caratterizzato, si deve ricordare che esiste anche la possibilità che la concentrazione di un enzima venga modificata alterando la stabilità dell enzima stesso, ovvero la velocità con cui viene degradato. Il ricambio delle proteine cellulari è un processo ben caratterizzato: ciascuna proteina ha un tempo di emivita definito. La stabilità di un enzima può dipendere da fattori diversi, quali: l interazione con metalli, l interazione con coenzimi, l interazione con altre molecole e modifiche covalenti che possono modificarne la conformazione e renderlo quindi più suscettibile ai processi degradativi. Esistono enzimi (ad esempio l arginasi epatica) la cui concentrazione può essere regolata da modifiche della stabilità proteica, ovvero della suscettibilità alla degradazione. La regolazione della concentrazione enzimatica tramite variazioni della sintesi e/o della degradazione è un meccanismo efficace ma piuttosto lento, che generalmente sottende adattamenti a lungo termine. Gli adeguamenti cellulari a rapidi cambiamenti dell ambiente esterno sono più spesso mediati da modificazioni istantanee, ma transitorie, della capacità catalitica degli enzimi. Questo tipo di regolazione si esplica attraverso tre modalità diverse (1) la regolazione allosterica (2) la regolazione tramite modifiche covalenti (3) la regolazione proteolitica.

27 La regolazione allosterica. L efficienza di alcuni enzimi può essere sensibilmente modificata dalla presenza di molecole di diversa natura (effettori) che, interagendo con l enzima tramite siti diversi dal sito attivo, ne modificano la conformazione e quindi l attività catalitica. Enzimi con queste caratteristiche vengono detti allosterici; si tratta generalmente di enzimi che esplicano il ruolo fondamentale di regolatori nel contesto di vie metaboliche, catalizzando la reazione limitante dell intero processo. La modulazione della loro attività consente il controllo dell intero percorso metabolico. Spesso sono proteine multimeriche con un sito attivo ed uno o più siti allosterici. L occupazione dei siti allosterici da parte di un ligando influenza il legame del substrato e può determinare sia l incremento che il rallentamento della catalisi. La cinetica di saturazione degli enzimi allosterici è descritta da una curva di tipo sigmoide, e non da un iperbole tipica del modello di Michaelis-Menten. Questo comportamento cinetico riflette spesso un interazione (indiretta) tra effettore ed enzima (spesso multimerico) : il legame dell effettoread una subunità ne determina modifiche strutturali che si ripercuotono sulle altre subunità dell enzima facilitando/inibendo il successivo legame del substrato.

28 Gli effettori sono spesso prodotti intermedi o finali della stessa via metabolica di cui fa parte l enzima del quale regolano l attività oppure di vie metaboliche diverse. Nel primo caso si tratta generalmente di un fenomeno di inibizione retrograda da prodotto, in cui il prodotto finale di una catena metabolica inibisce un enzima chiave dello stesso processo, per bloccare la sua stessa sintesi. Nel secondo caso si tratta invece di un importante modalità di connessione e comunicazione tra processi metabolici diversi.

29 Esempio di controllo allosterico: la protein chinasia (PKA) Molti ormoni esplicano la propria attività attraverso secondi messaggeri allosterici; esempi importanti che verranno approfonditi in seguito sono lo ione calcio e l adenosinmonofosfato ciclico (camp). La figura rappresenta l attivazione della protein chinasi A (PKA) da parte del camp. L effettore allosterico (camp) si lega alle subunità regolatrici di PKA, determinandone così modifiche conformazionali che consentono il distacco dalle subunità catalitiche; queste divengono così attive e in grado di fosforilare substrati diversi.

30 La regolazione tramite modifiche covalenti. Una vasta classe di enzimi regolatori viene invece modulata tramite modifiche covalenti della proteina. La fosforilazione/defosforilazione di enzimi rappresenta certamente il meccanismo di regolazione più comune. Si tratta di processi transitori e reversibili in cui un gruppo fosfato viene legato o distaccato da un residuo di serina, treonina o tirosina della catena aminoacidica di un enzima. Nel caso della formazione dell estere fosforico, il gruppo fosfato proviene da una molecola di adenosintrifosfato (ATP) o da un analoga molecola trifosfato. Tale reazione è catalizzata da enzimi come protein chinasi. Il distacco del fosfato dalla catena aminoacidica è un processo termodinamicamente spontaneo e catalizzato da proteine definite fosfoproteinfosfatasi. La rapidità con cui un enzima può passare da uno stato all altro rende tale meccanismo di estrema importanza per la regolazione enzimatica; consente infatti di innescare rapidamente un attività catalitica rispondendo in tempo reale ai mutati bisogni cellulari, per poi poter tornare altrettanto rapidamente allo stato basale. È bene ricordare che non esiste una corrispondenza univoca tra stato di fosforilazione degli enzimi e loro attività: ovvero il trasferimento di fosfati su enzimi determina attivazione per alcuni di essi ed inattivazione per altri. Se la fosforilazione/defosforilazione rappresenta il meccanismo più diffuso di modifica covalente e reversibile di enzimi, esistono modalità di regolazione mediate dal di trasferimento di gruppi chimici diversi dal fosfato; tra queste possiamo ricordare l adenilizaione (trasferimento di AMP), l uridilazione (trasferimento di UMP, nucleotide simile all AMP, in cui l adenina è sosttutita dall uracile) e la metilazione (trasferimento di metili).

31 La regolazione tramite proteolisi parziale. Il trasferimento di gruppi chimici diversi sugli enzimi rappresenta un meccanismo di regolazione transitorio e reversibile. Al contrario la regolazione che prevede la proteolisi parziale dell enzima è un meccanismo irreversibile. Alcuni enzimi sono sintetizzati come proenzimi o zimogeni privi di attività catalitica. L attivazione di questi zimogeni richiede uno o più tagli proteolitici che convertono il proenzima in enzima. Esempi di questo tipo di regolazione si hanno con gli enzimi della digestione (pepsina, pepsinogeno, tripsinogeno e chimotripsinogeno) e quelli della coagulazione del sangue e della lisi del coagulo (fattori XII, XI, X, II, plasminogeno).

32 La rottura di specifici legami peptidici determina modifiche conformazionali che espongono il sito attivo dell enzima. Essendo l attivazione per proteolisi un meccanismo irreversibile, il blocco dell attività catalitica così innescata dipende da inibitori proteici che si legano fortemente al sito attivo dell enzima. Lo stesso tipo di attivazione riguarda altre proteine del nostro organismo, con funzioni diverse da quella enzimatica. Esempio importante di preproteina attivata tramite proteolisi è quello dell insulina. Riepilogo Il mantenimento dell omeostasi cellulare, ovvero di un ambiente intracellulare relativamente stabile nonostante le numerosissime variazioni che avvengono nell ambiente esterno, è un processo estremamente importante e complicato, che prevede la regolazione continua di molte attività biochimiche cellulari. Questa regolazione si attua preferenzialmete modulando l attività degli enzimi, i catalizzatori biologici che determinano la velocità delle reazioni chimiche. La regolazione enzimatica si esplica attraverso meccanismi passivi, ovvero intrinseci alle caratteristiche di funzionamento della catalisi biochimica, e meccanismi attivi, che prevedono l intervento di molecole od effettori specifici. La regolazione passiva si basa sul fatto che molti enzimi hanno una K m vicina alle concentrazioni basali intracellulari del loro substrato; questo fa sì che, ad incrementi della disponibilità di substrato, l enzima possa intrinsecamente rispondere con un incremento della velocità di catalisi. A questa capacità di adattamento spontaneo si aggiunge una regolazione attiva, spesso innescata da stimoli ormonali o nervosi, che interviene soprattutto per adeguare lo stato metabolico a fattori esterni. Tale regolazione si manifesta sugli enzimi che catalizzano le tappe limitanti delle vie metaboliche (generalmente le reazioni irreversibili o le più lente). Si realizza attraverso modalità diverse: (1) variazioni della quantità di enzima disponibile, tramite induzione dell espressione o stimolazione della degradazione; (2) regolazione allosterica, come nel caso dell inibizione retrograda da prodotto; (3) innesco di modifiche covalenti, quali il trasferimento di gruppi fosfato o la proteolisi parziale del proenzima. COENZIMI E VITAMINE Introduzione Molti enzimi sono funzionali solo in presenza di cofattori che ne completano la specificità di interazione con il substrato o la capacità catalitica. Alcuni cofattori sono molecole organiche che agiscono spesso da co-substrato della reazione chimica; in questo caso sono denominati coenzimi. Molti coenzimi sono molecole essenziali che l organismo ottiene dalle vitamine del gruppo B. Le vitamine sono molecole organiche necessarie per l espletamento di numerose funzioni biologiche. Devono essere assunte con la dieta perché l organismo non è in grado di sintetizzarle. Obiettivi In questa lezione verranno illustrate le caratteristiche chimiche e le modalità d azione dei principali coenzimi presenti nelle cellule. Verranno anche descritte le vitamine del gruppo B da cui derivano questi coenzimi e infine verrà accennata la natura e le funzioni delle altre vitamine essenziali per il nostro organismo.

33 Coenzimi Spesso l attività degli enzimi dipende dalla presenza di componenti chimici addizionali chiamati cofattori; può trattarsi di ioni inorganici quali Fe 2+, Mg 2+ o Zn 2+, legati più o meno saldamente all enzima, oppure di molecole più complesse e di natura organica, più propriamente definite coenzimi. Quando tali coenzimi sono legati stabilmente all enzima vengono anche definiti gruppi prostetici. Nel caso di enzimi coniugati a cofattori/coenzimi, il termine di apoenzima definisce la porzione proteica dell enzima stesso, mentre quello di oloenzima indica il complesso funzionale nella sua completezza. I coenzimi sono molecole importanti per l attività di molti enzimi, specie di quelli che catalizzano il trasferimento di elettroni o gruppi di atomi da una molecola all altra. I coenzimi sono molecole organiche che partecipano attivamente alla trasformazione chimica catalizzata dall enzima. Spesso, a differenza dell enzima, che rimane immutato al termine della reazione, il coenzima può essere considerato un secondo substrato, che subisce nel corso della reazione chimica trasformazioni opposte a quelle del substrato principale. Per esempio, nella catalisi di una reazione di ossidoriduzione, quando una molecola di substrato viene ossidata, una molecola di coenzima viene ridotta. Oppure, nelle reazioni di trasferimento di gruppi funzionali, il coenzima può fungere da accettore finale o da trasportatore intermedio.

34 Le modifiche subite dal coenzima nel corso di una reazione chimica fanno sì che esso non possa essere disponibile per una nuova reazione senza essere prima riportato, attraverso altre reazioni chimiche, allo stato iniziale. Molti coenzimi sono molecole essenziali, ovvero non sintetizzabili dalle nostre cellule. Devono quindi essere introdotti con la dieta. Precursori metabolici di molti coenzimi sono le vitamine del gruppo B. Le vitamine sono nutrienti organici essenziali, ovvero molecole che, almeno in piccola quantità, devono essere apportate con la dieta in quanto la loro sintesi endogena è impossibile o comunque insufficiente rispetto alle esigenze fisiologiche dell organismo. Sono invece prodotte da microrganismi o vegetali. L assenza o la carenza di vitamine nella dieta può determinare situazioni patologiche diverse: ad esempio la pellagra, lo scorbuto, il beriberi sono tipiche manifestazioni dovute ad insufficiente apporto di vitamine con la dieta, tuttavia è bene ricordare che alcuni stati carenziali possono derivare non da una dieta non bilanciata, bensì da alterazioni dell assorbimento o del metabolismo di queste molecole. Sono noti

35 rachitismi resistenti all apporto di vitamina D, piuttosto che anemie perniciose associate al mancato assorbimento di vitamina B12. Classicamente le vitamine sono distinte in due gruppi: () le vitamine idrosolubili: le vitamine del gruppo B e la vitamina C () le vitamine liposolubili: le vitamine A, D, E e K. Le vitamine del gruppo B Sono molecole idrosolubili da cui derivano molti coenzimi essenziali per numerose trasformazioni biochimiche. Appartengono a questo gruppo un insieme di molecole che, a parte la loro idrosolubilità, presentano caratteristiche chimico-fisiche estremamente eterogenee. Esse sono: () la tiamina (vitamina B1), () la riboflavina (B2), () la niacina (B3), () l acido pantotenico (B5), () la piridossina (B6), () la biotina, () la cobalamina (B12) () l acido folico. Approfondiamo ora alcuni aspetti delle vitamine da cui derivano i coenzimi più importanti: Tiamina. Mostra la struttura della tiamina o vitamina B1, costituita da un anello pirimidinico legato ad un anello tiazolico. È presente, anche se in quantità limitate, in molti alimenti di origine animale e vegetale. La sua carenza, specie se associata al consumo di carboidrati, provoca il beriberi, che si manifesta con sintomi neurologici (neuropatia periferica), cardiovascolari e muscolari. Una carenza di tiamina si può riscontrare anche negli alcolisti cronici (encefalopatia di Wernicke). Il ruolo fondamentale della tiamina per il nostro organismo è quello di essere il precursore della tiamina pirofosfato, coenzima che partecipa soprattutto alle reazioni di decarbossilazione ossidativa di α chetoacidi e a quelle catalizzate dalla transchetolasi. Tra le prime è da ricordare la decarbossilazione del piruvato ad opera della piruvato deidrogenasi con trasformazione del piruvato in acetil-coa, tappa fondamentale per l ingresso nel ciclo di Krebs.

36 Niacina. Con il termine di Niacina (vitamina B3) si indicano collettivamente l acido nicotinico e l ammide da esso derivata (nicotinammide); entrambi sono fonti di vitamina B3. In natura sono buone sorgenti di tale vitamina le carni, i legumi e alcuni cereali. Diete prive di tali alimenti possono comportare l insorgenza di pellagra (tipica delle popolazioni che utilizzano il mais quale alimento fondamentale); tuttavia il nostro organismo può in parte sopperire al mancato apporto di niacina, trasformando il triptofano in NAD+. L importanza della nicotinammide deriva dal fatto che è il precursore di due coenzimi necessari per la catalisi di numerosissime reazioni cellulari: nicotinammide adenina dinucleotide (NAD+) e nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADP). Questi nucleotidi nicotinammidici fungono da coenzimi per le reazioni di ossidoriduzione catalizzate da deidrogenasi presenti sia nel citosol che nei mitocondri, e coinvolte nel metabolismo delle principali macromolecole utilizzate dalle cellule (carboidrati, lipidi, aminoacidi). Il NAD partecipa in genere ai processi catabolici, mentre il NADP a quelli anabolici.

37 Il ruolo di questi coenzimi nelle reazioni di ossidoriduzione è fondamentale in quanto subiscono una modificazione chimica opposta a quella del vero substrato della reazione. Quando vengono utilizzati nella forma ossidata (NAD+ e NADP) sono ridotti a NADH e NADPH. Per garantire adeguati livelli cellulari di coenzimi nicotinammidici, le forme ridotte vengono riossidate tramite ossidoriduzioni specifiche, in cui fungono da riducente. È importante ricordare che la cessione di equivalenti riducenti da parte del NADH alla catena mitocondriale di trasporto degli elettroni, è la tappa iniziale e fondamentale per la produzione di energia chimica nella cellula.