Chimica Biologica A.A Glicolisi. Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

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1 Chimica Biologica A.A Glicolisi Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

2 Glicolisi Glicolisi - via di degradazione del glucosio (1940) - glucosio = maggior sorgente di energia metabolica nelle cellule - 10 reazioni enzimatiche - gli enzimi della glicolisi sono localizzati nel citosol - ruolo chiave nel metabolismo energetico: fornisce una porzione significativa dell energia libera utilizzata dagli organismi - prepara il glucosio e altri composti per ulteriori degradazioni ossidative - 1 molecola di glucosio (aldoesoso) è convertita in 2 molecole di piruvato (unità C 3 ). L energia libera rilasciata viene utilizzata per la sintesi di 2 molecole di ATP a partire da ADP e P i, con concomitante riduzione di 2 molecole di NAD + a NADH

3 Glicolisi Glicolisi - la glicolisi è una via ubiquitaria - la glicolisi è un processo anaerobico (non richiede ossigeno) precoce via metabolica per estrarre energia dalle molecole nutritive -negli aerobi la glicolisi è solo la parte iniziale di un processo degradativo più ampio per la produzione di energia e che porta alla completa ossidazione del substrato con l impiego di O 2 come ossidante -negli anaerobi la glicolisi avviene senza ossidazione netta del substrato fermentazione (molti anaerobi dipendono completamente dalla glicolisi per la produzione di energia)

4 Glicolisi Destino metabolico del piruvato condizioni aerobiche - negli organismi aerobici il piruvato subisce una decarbossilazione ossidativa per dare vita ad una unità bicarboniosa (gruppo acetilico dell acetil-coa) - il gruppo acetilico viene completamente ossidato a 2 molecole di CO 2 nel ciclo dell acido citrico con riduzione di NAD + e FAD - gli elettroni rimossi vengono trasferiti al sistema di trasporto degli elettroni mitocondriali (riossidazione di NADH e FADH 2 ) ed utilizzati per generare molecole di ATP (fosforilazione ossidativa)

5 Glicolisi Destino metabolico del piruvato condizioni anaerobiche - il piruvato è convertito in un prodotto ridotto con riossidazione del NADH prodotto dalla reazione della GAPDH (gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi) 2 modi: - lievito (fermentazione alcolica) il piruvato viene decarbossilato a CO 2 ed acetaldeide che viene poi ridotta dal NADH ottenendo NAD + ed etanolo - muscolo (fermentazione omolattica) il piruvato viene ridotto a lattato per rigenerare il NAD +

6 Glicolisi Destino metabolico del piruvato

7 Glicolisi Glicolisi - gli organismi utilizzano la glicolisi per fornire i precursori delle vie metaboliche aerobiche (ciclo dell acido citrico) o come sorgenti di energia a breve termine quando l ossigeno è presente in quantità limitanti - negli animali un costante rifornimento di glucosio è fondamentale per tessuti come cervello e globuli rossi che usano il glucosio quasi come unica fonte di energia metabolica - microorganismi, piante ed animali compiono le 10 reazioni della glicolisi in modo simile (velocità singole reazioni e modalità di regolazione variano da specie a specie

8 Glicolisi - 2 fasi Glicolisi reazioni 1-5: investimento energetico si consumano 2 molecole di ATP ed il glucosio è scisso in 2 molecole di gliceraldeide-3-fosfato (G3P) reazioni 6-10: recupero energetico le 2 molecole di G3P sono convertite in 2 molecole di piruvato con formazione di 4 molecole di ATP resa netta di 2 molecole di ATP reazione complessiva: glucosio + 2 NAD ADP + 2 P i 2 piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H 2 O + 2 H +

9 Glicolisi reazioni 1-5: investimento energetico gli intermedi glicolitici sono fosforilati - i gruppi fosforici che vengono trasferiti dall ATP all esoso nelle prime reazioni, non danno luogo a composti ad alta energia

10 Glicolisi reazioni 6-10: recupero energetico gli intermedi glicolitici sono fosforilati - le reazioni enzimatiche convertono i prodotti a bassa energia generati nella prima fase in composti con alti potenziali di trasferimento del gruppo fosforico che sono in grado di fosforilare ADP a formare ATP

11 Glicolisi Perchè è necessaria una fase preparatoria in cui si consuma ATP? - le due fosforilazioni ATP-dipendenti sono due reazioni fortemente esoergoniche che creano due passaggi irreversibili, che avvengono in condizioni lontane dall equilibrio (tappe di comando) all inizio della via metabolica - le due fosforilazioni della prima fase fanno sì che tutti gli intermedi glicolitici siano fosforilati composti fosforilati sono dotati di carica netta negativa e non possono diffondere all esterno della cellula - la presenza di gruppi fosforici nei substrati rende le reazioni enzimatiche più specifiche gli enzimi della glicolisi legano gli intermedi glicolitici interagendo in larga misura con i loro gruppi fosfato

12 Glicolisi: I fase 1) Esochinasi (chinasi di esosi) reazione: trasferimento gruppo fosforico dall ATP al glucosio con formazione di glucosio-6-fosfato (G6P) esochinasi: enzima ubiquitario poco specifico che catalizza la fosforilazione di vari esosi (D-glucosio, D-mannosio, D-fruttosio) + H +

13 Glicolisi: I fase 1) Esochinasi -complesso Mg 2+ -ATP è il secondo substrato per l esochinasi -Mg 2+ essenziale per l attività della chinasi gli ioni Mg 2+ schermano le cariche negative degli atomi di ossigeno sui gruppi fosforici α e β oppure β e γ rendendo l atomo di fosforo γ più suscettibile all attacco nucleofilico del gruppo C6-OH del glucosio

14 Glicolisi: I fase 1) Esochinasi glucosio - il legame del glucosio avvicina i 2 lobi della proteina (8Å) - il movimento porta l ATP vicino al gruppo C6H 2 OH del glucosio escludendo molecole d acqua dal sito attivo (catalisi da effetti di prossimità) polarità sito attivo ridotta favorito l attacco nucleofilo evitata la reazione di idrolisi dell ATP (trasferimento termodinamicamente favorito del gruppo fosforico a H 2 O)

15 Glicolisi: I fase 2) Fosfoglucosio isomerasi reazione: conversione di G6P in fruttosio-6-fosfato (F6P) Fosfoglucosio isomerasi (PGI): isomerizzazione di un aldosio in un chetosio (apertura anello, isomerizzazione, chiusura anello) - la reazione avviene in condizioni vicine all equilibrio

16 Glicolisi: I fase 3) Fosfofruttochinasi reazione: fosforilazione del F6P a formare fruttosio-1,6-bisfosfato (FBP, o F1,6P) - reazione simile a quella catalizzata dall esochinasi: attacco nucleofilico del gruppo C1-OH dell F6P sull atomo di fosforo γ elettrofilico del complesso Mg 2+ -ATP - fosfofruttochinasi (PFK): opera in condizioni lontane dall equilibrio punto di controllo maggiore della glicolisi - la PFK è un enzima allosterico, che risponde a vari effettori eterotropici

17 Glicolisi: I fase 3) Fosfofruttochinasi - enzima tetramerico in 2 stati conformazionali R e T in equilibrio Mg 2+ -ATP Mg 2+ -ADP - ATP è sia substrato sia inibitore allosterico di PFK (2 siti di legame distinti) - ADP, AMP e F2,6P rimuovono gli effetti inibitori dell ATP attivatori allosterici F6P F6P Mg 2+ -ATP Mg 2+ -ADP 2 subunità dell enzima tetramerico (ulteriore asse binario verticale)

18 Glicolisi: I fase 3) Fosfofruttochinasi - legame ATP (substrato): uguale efficienza di legame sia per stato T che R - legame ATP (inibitore) legame di ATP quasi solo in conformazione T - legame F6P legame di preferenza in stato R ad alta conc. l ATP agisce come inibitore allosterico di PFK legandosi allo stato T e spostando l equilibrio T R verso T (curva iperbolica curva sigmoidale) - gli attivatori AMP e ADP bilanciano l inibizione da ATP legandosi allo stato R (stabilizzandolo) e spostando l equilibrio T R verso R

19 Glicolisi: I fase 4) Aldolasi reazione: scissione del FBP a formare 2 triosi: la gliceraldeide-3-fosfato (GAP) e il diidrossiacetone fosfato (DHAP) - reazione di scissione aldolica (inverso di una condensazione aldolica) - la scissione avviene sulla forma aperta del substrato mediante catalisi covalente (basi di Schiff) e catalisi acido-base

20 Glicolisi: I fase 4) Aldolasi - cambio numerazione atomi C - isomerizzazione G6P a F6P permette la formazione di 2 composti C3 convertibili l uno nell altro - la scissione aldolica di G6P porterebbe a prodotti di diverso numero di atomi di C

21 Glicolisi: I fase 4) Aldolasi 1) legame substrato 2) reazione gruppo carbonilico di FBP con gruppo ε-amminico Lys del sito attivo formazione base di Schiff protonata 3) rottura legame C3-C4 con rilascio di GAP e formazione di enammina 4) protonazione dell enammina a catione imminico 5) idrolisi catione imminico, rilascio DHAP e rigenerazione dell enzima

22 Glicolisi: I fase Base di Schiff R R R H + + R NH 2 + C O R N C OH R N C + H 2 O : R : H ammina aldeide o chetone intermedio immina carbinolammina (base di Schiff) R H R

23 Glicolisi: I fase 5) Trioso fosfato isomerasi (TIM) GAP e DHAP (isomeri chetosio-aldosio) prodotti della scissione aldolica. Solo GAP prosegue lungo la via glicolitica reazione: isomerizzazione con un intermedio enediolo (o enediolato) che permette l interconversione della gliceraldeide-3-fosfato (GAP) e del diidrossiacetone fosfato (DHAP)

24 Glicolisi: I fase 5) Trioso fosfato isomerasi (TIM) TIM permette ad ambedue i prodotti della reazione aldolasica di procedere nella via glicolitica

25 Glicolisi: I fase 5) Trioso fosfato isomerasi (TIM) conversione di GAP nell intermedio enediolo Glu165 base generale che sottrae un protone dal C2 di GAP His95 acido generale che protona l O carbonilico di GAP His95 base generale che sottrae un protone dal gruppo OH Glu165 acido generale che protona il C1 conversione dell intermedio enediolo in DHAP

26 Glicolisi: I fase 5) Trioso fosfato isomerasi (TIM) - quando il substrato si lega a TIM una ansa di 10 residui (lid) si richiude sul substrato - la chiusura del lid: (1) stabilizza di preferenza lo stato di transizione della reazione (2) impedisce la degradazione dell intermedio enediolo - in soluzione l intermedio enediolo si decompone rapidamente in metilgliossale (tossico) e P i - altri TIM barrel: aldolasi, enolasi, piruvato chinasi H C H 3 C O C O

27 Glicolisi: I fase 5) Trioso fosfato isomerasi (TIM) - TIM ha raggiunto la perfezione catalitica la velocità della reazione bimolecolare tra enzima e substrato è controllata dalla diffusione (la formazione del prodotto avviene con la stessa velocità con cui enzima e substrato possono collidere in soluzione) - GAP e DHAP sono interconvertiti in modo così efficiente che [GAP] e [DHAP] sono mantenute a valori tipici della situazione all equilibrio k = [GAP] / [DHAP] = (quindi all equilibrio [DHAP] >> [GAP]) ma nello stato stazionario della cellula GAP viene consumata nella glicolisi maggior DHAP viene convertito in GAP per mantenere il rapporto della situazione di equilibrio

28 Glicolisi: I fase Prima fase glicolisi un esoso viene: - fosforilato - isomerizzato - scisso in 2 triosi fosfati interconvertibili vengono consumati 2 ATP

29 Glicolisi: II fase Seconda fase glicolisi - i due gruppi fosforici provenienti dall ATP introdotti nell esoso nella prima fase vengono entrambi recuperati nella seconda, sotto forma di ATP - nella seconda fase, un gruppo fosforico viene introdotto in un intermedio a 3 atomi di carbonio (bisfosfoglicerato) a partire da fosfato inorganico (ortofosfato) questi gruppi fosforici (2 mol per mol di glucosio) vengono trasferiti all ADP a dare ATP

30 Glicolisi: II fase 6) Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) reazione: ossidazione e fosforilazione di GAP ad opera di NAD + e P i con sintesi di 1,3-bisfosfoglicerato (1,3-BPG) - l ossidazione dell aldeide (reazione esoergonica) promuove la sintesi dell acil fosfato 1,3-BPG che è un composto ad alta energia (gli acil fosfati hanno un alto potenziale di trasferimento del gruppo fosforico)

31 Glicolisi: II fase 6) Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) reazione: ossidazione e fosforilazione di GAP ad opera di NAD + e P i con sintesi di 1,3-bisfosfoglicerato (1,3-BPG) - l ossidazione dell aldeide (reazione esoergonica) promuove la sintesi dell acil fosfato 1,3-BPG che è un composto ad alta energia (gli acil fosfati hanno un alto potenziale di trasferimento del gruppo fosforico) - 1,3-BPG contiene infatti un gruppo anidridico misto con energia libera di idrolisi molto negativa

32 Glicolisi: II fase 6) Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) attacco nucleofilico del gruppo sulfidrilico all aldeide formazione del tioemiacetale ossidazione del tioemiacetale da parte del NAD + ad acil tioestere legame di GAP all enzima un altra molecola di NAD + sostituisce in NADH si rigenera l enzima e si forma l anidride mista ad alta energia 1,3-BPG l intermedio tioestere subisce l attacco nucleofilico del P i

33 Glicolisi: II fase 6) Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) - catalisi covalente ed acido-basica - l energia ottenuta dall ossidazione della aldeide non viene dissipata ma conservata grazie alla sintesi del tioestere e della riduzione del NAD + a NADH infatti: - il gruppo aldeidico è ossidato non direttamente a gruppo carbossilico ma inizialmente a gruppo tioestere - i tioesteri hanno un elevato potenziale di trasferimento del gruppo acile

34 Glicolisi: II fase 7) Fosfoglicerato chinasi (PGK) reazione: chinasi perchè la reazione inversa è il trasferimento di un gruppo fosforico a 3PG formazione di ATP e di 3-fosfoglicerato (3PG)

35 Glicolisi: II fase 7) Fosfoglicerato chinasi (PGK) - struttura bilobata - sito di legame Mg 2+ -ADP su un dominio - sito di legame 1,3-BPG sull altro dominio (distanza ~10Å) - avvicinamento dei 2 domini reazione in ambiente privo di acqua meccanismo catalitico simile ad esochinasi con il coinvolgimento di un fenomeno di adattamento indotto (ma strutture scorrelate)

36 Glicolisi: II fase 6-7) Accoppiamento reazioni GAPDH e PGK GAP + P i + NAD + 1,3-BPG + NADH ΔG = kj/mole 1,3-BPG + ADP 3PG + ATP ΔG = kj/mole GAP + P i + NAD + + ADP 3PG + NADH + ATP ΔG = kj/mole - anche se la reazione della GAPDH è endoergonica, il trasferimento del gruppo fosforico dall 1,3-BPG all ADP è fortemente esoergonico e rende possibile la reazione complessiva - il consumo dell intermedio comune 1,3-BPG nella reazione della PGK spinge a compimento la reazione della GAPDH fosforilazione a livello del substrato: produzione di ATP che non implica l utilizzo di O 2 successivamente vedremo la fosforilazione ossidativa: produzione di ATP mediante ossidazione di NADH da parte di O 2

37 Glicolisi: II fase 8) Fosfoglicerato mutasi (PGM) reazione: la mutasi è una transferasi ch catalizza il trasferimento di un gruppo funzionale all interno della stessa molecola conversione (isomerizzazione) di 3-fosfoglicerato (3PG) in 2-fosfoglicerato (2PG) reazione energeticamente quasi neutrale, ma importante per generare il precursore del composto ad alta energia successivo

38 Glicolisi: II fase 8) Fosfoglicerato mutasi (PGM) non è un semplice trasferimento intramolecolare di un gruppo fosforico 3PG si lega al fosfoenzima (His 8 è fosforilata) il complesso si decompone con formazione di 2PG e rigenerazione del fosfoenzima attivo il gruppo fosforico dell enzima viene trasferito a 3PG (intermedio bisfosforilato)

39 Glicolisi: II fase 9) Enolasi reazione: l enolasi è una liasi che catalizza la deidratazione di 2PG con formazione di fosfoenolpiruvato conversione di 2-fosfoglicerato (2PG) in fosfoenolpiruvato (PEP) (PEP: secondo intermedio ad alta energia ) l energia libera standard di idrolisi del 2PG èsolo-16 kj/mole insufficiente per la sintesi di ATP partendo da ADP (ΔG = -30 kj/mole) - l enzima forma un complesso con Mg 2+ prima che si leghi il substrato

40 Glicolisi: II fase 10) Piruvato chinasi (PK) reazione: scissione di PEP catalizzata dalla piruvato chinasi (transferasi) e sintesi di ATP - reazione fortemente esoergonica (fornisce energia libera sufficiente per la sintesi di ATP) -esempio di fosforilazione a livello del substrato: produzione di ATP che non implica l utilizzo di O H + - necessaria la presenza di cationi K + e Mg 2+

41 Glicolisi: II fase 10) Piruvato chinasi (PK) (1) un atomo di ossigeno del gruppo fosforico β dell ADP attacca in modo nucleofilico l atomo di fosforo del PEP formazione di enolpiruvato ed ATP (2) l enolpiruvato tautomerizza a piruvato

42 Glicolisi: II fase 10) Piruvato chinasi (PK) - l alto potenziale di trasferimento del gruppo fosforico del PEP riflette il grande rilascio di energia libera dovuto alla conversione di enolpiruvato nel suo tautomero in forma chetonica, che avviene dopo il rilascio del gruppo fosfato

43 Glicolisi: II fase Seconda fase glicolisi -sintesi di4 ATP (2 per GAP) - la parziale ossidazione del glucosio porta alla formazione di 2 molecole di piruvato che sono ancora relativamente in una forma ridotta condizioni aerobiche: la completa ossidazione degli atomi di carbonio del piruvato a CO 2 è mediata dal ciclo dell acido citrico l energia rilasciata da questo processo promuove la sintesi di molto più ATP di quello generato dalla glicolisi condizioni anaerobiche: il piruvato viene metabolizzato solo in parte per rigenerare il NAD +

44 Glicolisi Sommario delle 10 reazioni della glicolisi

45 Glicolisi Bilancio della glicolisi la stechiometria complessiva della glicolisi è: Glucosio + 2NAD + + 2ADP + 2P i 2Piruvato + 2NADH + 2H ATP + 2H 2 O ATP: investimento di 2 ATP nella prima fase e sintesi di 4 ATP (2 per GAP) nella seconda fase resa netta di 2 ATP x glucosio NADH: durante la glicolisi il glucosio viene parzialmente ossidato consentendo di ridurre 2 molecole di NAD + a NADH NADH rappresenta una fonte di energia libera recuperabile mediante successiva ossidazione condizioni di aerobiosi trasporto di elettroni organismi anaerobici fermentazione

46 Glicolisi Controllo della glicolisi - in condizioni fisiologiche solo 3 reazioni (HK, PFK, PK) avvengono con grande diminuzione di energia libera (condizioni lontane dall equilibrio) - HK non è necessaria visto che nel muscolo scheletrico la fonte di G6P non è il glucosio ma il glicogeno - PK catalizza l ultima reazione e quindi è improbabile che sia il principale punto di regolazione PFK maggior punto di controllo della glicolisi