REF 70941: HISTO TYPE Celiac Disease

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1 Istruzioni d uso HISTO TYPE Celiac Disease Media risoluzione 0123 Kit per la tipizzazione tissutale degli alleli HLA (II Classe: HLA-DR, DQA, DQB) in biologia molecolare IVD 20 tipizzazioni pronte all uso prealiquotate REF 70941: HISTO TYPE Celiac Disease (24 mixes, giallo) Indice 1. Introduzione Informazioni di base Descrizione del prodotto Materiale Contenuto dell HISTO TYPE Celiac Disease Materiale supplementare necessario Conservazione e stabilità Dati per l esecuzione Procedura del test Condizioni di sicurezza ed indicazioni speciali Estrazione del DNA Amplificazione Elettroforesi del gel Documentazione ed interpretazione Avvertenze e precauzioni Soluzione dei problemi Referenze Spiegazione dei simboli usati sulle etichette Versione: 08/2010 BAG Health Care GmbH Auftragsannahme/Ordering: Customer Service: Amtsgerichtsstraße 1-5 Tel.: +49 (0) 6404 / Tel.: +49 (0) 6404 / Tel.: +49 (0) 6404 / Lich / Germany Fax: +49 (0) 6404 / info@bag-healthcare.com Fax: +49 (0) 6404 / Fax: +49 (0) 6404 / verkauf@bag-healthcare.com service@bag-healthcare.com

2 1. Introduzione 1.1 Informazioni di base La Malattia celiaca (CD, Celiac Disease) è un disordine genetico che colpisce bambini ed adulti di entrambi i sessi. Può iniziare ad ogni età, dall'infanzia (con la prima assunzione di grani di cereali) a un qualsiasi momento della vita (anche se fino a quel dato momento la dieta comprendeva cereali). I soggetti affetti da questa malattia sono incapaci di digerire i cibi contenenti glutine, che si trova soprattutto nel grano, nell'orzo, nell'avena e in altri cereali. Nei malati di celiachia, il glutine scatena una reazione autoimmune che causa la distruzione dei villi dell'intestino tenue: il sistema immunitario di questi soggetti produce anticorpi che attaccano l'intestino, causandone gravi danni che si riflettono in spossatezza, deficienza nutritiva, ecc... L'insorgenza della patologia sembra richiedere due requisiti: una predisposizione genetica e un fattore scatenante. Questo interruttore può essere di carattere ambientale (ad es. sovraesposizione al grano), psicologico (stress severo), fisico (stato di gravidanza, postumi di una operazione) o patologico (infezione virale). Poiché il 5-10% dei parenti di primo grado (genitori, figli, fratelli) dei soggetti celiaci sviluppa a sua volta la malattia, esiste una chiara tendenza famigliare: per un trattamento precoce, è pertanto essenziale una diagnostica veloce ed affidabile. Come già ricordato, la celiachia si manifesta solo in individui predisposti geneticamente. L'ereditarietà genetica della malattia celiaca è fortemente associata con quella di HLA- DQA1*05-DQB1*02 (HLA-DQ2) e HLA-DQA1*03-DQB1*0302 (HLA-DQ8). Questi alleli rappresentano gli antigeni di attacco per gli autoanticorpi prodotti nello stato patologico. Più del 90% delle persone con celiachia portano uno di questi alleli, o DQ2 o DQ8 (contro il 25% nella popolazione generale). Pertanto, la rilevazione mediante genetica molecolare dei genotipi HLA-DQ2 o HLA-DQ8 è uno strumento molto potente nella diagnosi della malattia. Quando un paziente con malfunzione gastrointestinale non presenta il marker DQ2 o DQ8, si può quasi escludere la malattia celiaca come causa. 2 di 12

3 1.2 Descrizione del prodotto Recentemente nella tipizzazione HLA sono stati fatti molti progressi mediante l utilizzo della Polymerase Chain Reaction (PCR). Il sequenziamento degli alleli HLA [1] ha reso possibile la tipizzazione a livello del DNA con una risoluzione più alta e con molti vantaggi rispetto all uso tradizionale del metodo sierologico. Il materiale base per la tipizzazione con gli HISTO TYPE SSP kits è il DNA purificato. La procedura del test viene effettuato utilizzando il Sequence Specific Primers (SSP) -PCR (vedi Fig. 1) [2,3]. Questo metodo si basa sull estensione del primer, e perciò la riuscita della PCR dipende da un esatto match all estremità 3' di entrambi i primers. Perciò, solo se i primers sono complementari alla sequenza avviene l amplificazione, che viene di seguito evidenziata dall elettroforesi del gel di agarosio. Match esatto Amplificazione Amplificazione (Allele specifico) Mismatch Nessuna Amplificazione (Allele non specifico) Fig. 1: Principio della SSP-PCR La composizione delle positività delle mixes dei primer rende possibile una chiara identificazione della tipizzazione HLA indicata nel diagramma di interpretazione. Per ogni tipizzazione vengono usati un certo numero di mixes (24) prealiquotate e liofilizzate nelle quali è incluso il controllo di amplificazione interno con un volume finale di 10 µl. 3 di 12

4 2. Materiale 2.1 Contenuto dell HISTO TYPE Celiac Disease kit 20 piastre HISTO TYPE sufficienti per 20 tipizzazioni HLA. Le miscele delle reazioni prealiquotate e liofilizzate, includono i primers alleli specifici, i primers del controllo interno (specifici per il gene G3PDH umano) e nucleotidi. La prima mix di reazione è chiaramente contrassegnata (si prega di controllare lo schema di dispensazione delle mix a pag. 7) ed ogni piastra ha stampato il numero di lotto. 24 mix incluso il controllo di contaminazione con i primers interni di controllo e i primers di amplificazione specifici. PCR-buffer 10x sufficiente per 20 tipizzazioni. 12 strisce di tappi à 8 sufficienti per 20 tipizzazioni. Istruzioni d uso, tabella delle specificità, diagramma d interpretazione e fogli di lavoro. 2.2 Materiale necessario supplementare Taq Polimerasi (5 U/µl). BAG EXTRA-GENE (facoltativo) Kit per l estrazione di DNA da sangue / linfociti / leucociti o materiale per altri metodi di estrazione di DNA. Pipette a pistone (0,5-250 µl). Punte sterili con filtro. Termociclatore (per es. PTC 200 con coperchio termostatato, MJ Research/BioRad) Dispositivi e materiale per l elettroforesi del gel DNA agarosio Buffer TBE 0.5 x (45 mm di Tris, 45 mm di acido borico, 0,5 mm di EDTA). Etidio bromuro (EtBr). Cella elettroforetica. DNA-length standard (Cat.-No.: 7097) Alimentatore di corrente ( V, 200 ma) 4 di 12

5 Dispositivi per l interpretazione e la documentazione Transilluminatore UV ( nm) Macchina fotografica (per es. sistema Polaroid) con pellicola (Polaroid tipo 667) 2.3. Conservazione e stabilità Il kit è fornito senza ghiaccio secco. Conservare tutti i reagenti a C al buio. La data di scadenza viene indicata sull etichetta di ogni reagente ed è valida anche per i reagenti aperti. La data di scadenza indicata sull etichetta esterna si riferisce al reagente contenuto nel kit con la stabilità più breve. Scongelare brevemente il PCR-buffer 10 x prima dell uso. 3. Dati per l esecuzione Sensibilità analitica : Viene garantita una tipizzazione attendibile usando ng di DNA per ciascuna mix di reazione. Specificità diagnostica: La composizione della positività delle mix dei primers garantisce un identificazione attendibile della tipizzazione HLA (basata sugli ultimi dati di sequenza) indicate nel diagramma d interpretazione. Gli aggiornamenti saranno effettuati regolarmente. Per ogni lotto la specificità di ogni mix è stata verificata con DNA da campioni di riferimento: ogni reazione PCR è stata testata positivamente almeno una volta. Gli alleli, non inclusi che per la loro rarità non sono stati rispettivamente testati, sono indicati nel diagramma d interpretazione o nella tabella delle specificità. E stato eseguito uno studio della performance per l HISTO TYPE Celiac Disease con almeno 50 campioni di DNA. Il confronto dei risultati ottenuti e le tipizzazioni ottenute con kits SSP di un altro fornitore, non mostrano discrepanze. 5 di 12

6 4. Procedura del test 4.1 Condizioni di sicurezza ed indicazioni speciali La PCR è un metodo particolarmente sensibile e dovrebbe essere eseguito da personale debitamente addestrato con esperienza in tecniche di genetica molecolare e in istocompatibilita. Dovrebbero essere seguite le linee guida dei trapianti così come gli standard EFI per ridurre i rischi di false tipizzazioni, nel caso particolare di discrepanze nel metodo sierologico e quello della genetica molecolare. Si devono osservare condizioni speciali di sicurezza per evitare contaminazioni e perciò false reazioni: Indossare i guanti durante il lavoro (se possibile senza polvere). Usare nuove punte per ogni semina (con filtro integrato). Usare aree di lavoro separate per la pre-amplificazione (estrazione del DNA e preparazione delle reazioni) e post-amplificazione (elettroforesi del gel, documentazione). Usare preferibilmente due stanze separate. Usare dispositivi ed altro materiale solo nei rispettivi posti e non scambiarli. 4.2 Estrazione del DNA Per la tipizzazione HLA-SSP di un paziente sono richiesti 2-3 µg di DNA (corrispondenti approssimativamente a 0.5 ml di sangue). Per es. il BAG EXTRA-GENE kit è ideale per l estrazione poiché il DNA puro lo si può ottenere da sangue intero in breve tempo senza usare chimici tossici o solventi. Inoltre, altri metodi descritti nella letteratura [5] come il metodo cloroformio-trietil-ammonio-bromuro (CTAB) o la purificazione fenolo-cloroformio sono idonei per fornire una sufficiente purezza del DNA. La presenza di eparina potenzialmente inibisce la PCR [6]. Perciò per la tipizzazione si consiglia sangue in EDTA o citrato. Il DNA dovrebbe avere una purezza (rapporto di estinzione OD 260 /OD 280 ) tra 1.5 e Amplificazione Tutte le mixes prealiquotate e liofilizzate contengono già i primers allele-specifici, i primers di controllo e i nucleotidi. Questi sono forniti liofilizzati nel fondo delle provette di reazione. I parametri di amplificazione sono ottimizzati ad un volume finale di 10 µl. 6 di 12

7 1.: Prelevare il numero richiesto di piastre HISTO TYPE HLA-SSP da - 20 C e scongelare il PCR-buffer 10 x a temperatura ambiente. 2.: Preparare la Master-Mix composta da PCR-buffer 10 x, soluzione DNA, Taq- Polymerase e Aqua dist. e miscelare bene. L HISTO TYPE Celiac Disease kit lavora con la stessa Master-Mix come gli altri BAG HISTO TYPE SSP Kits e perciò possono essere combinati. La composizione della Master-Mix è esposta nella Tabella 1 (p.7). Se si deve eseguire un controllo di contaminazione, preparare prima la Master-Mix senza la soluzione di DNA e seminare 10 µl di questa miscela nel controllo di contaminazione. In seguito aggiungere la soluzione di DNA e distribuire la Master- Mix nelle provette di reazione preseminate. Tabella 1: Composizione della Master-Mix nr. di mix Acqua dist. 10 x PCR buffer Soluzione DNA (25-40 ng/µl) Taq-Polymerase (5 U/µl) Volume totale ,2 280 µl la quantità di DNA dovrebbe essere compresa tra 50 e 80 ng per mix. A seconda della concentrazione di DNA, occorre variare le quantità di acqua e DNA da aggiungere. (per es. per 24 mixes: 28,0 µl soluzione di DNA (50 ng/µl) e 222 µl Acqua dist.). 3.: Dopo aver vortexato aggiungere immediatamente 10 µl di questa miscela alle miscele di reazione preseminate e liofilizzate. Cambiare il puntale dopo ogni semina. Chiudere bene le provette con i rispettivi tappi. Assicurarsi di non toccare con le dita la parte Marcatura..... interna dei tappi ed il bordo superiore delle provette, per evitare la contaminazione. Se si usano termociclatori con coperchio a chiusura ermetica, è anche possibile usare PCR mat riciclabili. Scuotere leggermente la piastra verso il basso per dissolvere il pellet blu sul fondo della piastra. Tutte le soluzioni PCR dovrebbero depositarsi sul fondo. 7 di 12

8 4.: Mettere le provette di reazione nel termociclatore e chiudere il coperchio in modo che le provette di razione non si deformino riscaldandosi. Iniziare il programma PCR. Se viene usato un coperchio termostato non è necessario aggiungere olio minerale all interno delle provette! Parametri di amplificazione: Programma-Step Temp. Tempo Numero di cicli Prima denaturazione 96 C 5 Min 1 ciclo Denaturazione 96 C 20 Sec 5 ciclo Annealing+Estensione 68 C 1 Min Denaturazione 96 C 20 Sec 10 ciclo Annealing 64 C 50 Sec Estensione 72 C 45 Sec Denaturazione 96 C 20 Sec 15 ciclo Annealing 61 C 50 Sec Estensione 72 C 45 Sec Estensione finale 72 C 5 Min 1 ciclo Tipi di termociclatore: PTC 100 / 200 (MJ Research/ BioRad), GeneAmp PCR- System 9600 / 9700 (utilizzare per favore modalità di riscaldamento 9600) (ABI) e Mastercycler epgradient S (Eppendorf) Con termociclatori che hanno una velocità elevata di raffreddamento e riscaldamento, si consiglia comunque di utilizzare un programma di ramping a velocità inferiore. Poichè i termociclatori di produttori diversi hanno performance diverse ed anche i singoli apparecchi individuali dello stesso tipo possono funzionare in modo diverso, potrebbe essere necessario ottimizzare i parametri di amplificazione. Per ottimizzare il Vs. apparecchio seguire le istruzioni seguenti: Con reazioni false positive (bande non specifiche, additional types): aumentare la temperatura di annealing di 1 C. Con reazioni false negative (bande assenti): diminuire la temperatura di annealing di 1 C e/o aumentare i tempi di annealing di 5 secondi e/o aumentare i tempi di denaturazione di 5 secondi. Si consiglia di usare solo termociclatori regolarmente calibrati. Per questo il BAG- Cycler Check kit è ideale per il controllo del buon funzionamento del Vs. apparecchio (Cat.-No.: 7104). I test per il controllo di qualità sono stati eseguiti su un PTC-100/200 (MJ Research), 9700 (ABI) e Mastercycler epgradient S (Eppendorf). 8 di 12

9 4.4 Elettroforesi del gel La separazione dei prodotti ottenuti con l amplificazione si effettua tramite gel di agarosio in elettroforesi orizzontale. Si consiglia come tampone per l elettroforesi TBE 0.5 x (45 mm di tris, 45 mm di acido borico, 0.5 mm di EDTA). La concentrazione del gel dovrebbe essere % di agarosio. Lasciare polimerizzare il gel per almeno 30 minuti prima di caricare il campione. Al termine dell amplificazione, prelevare i campioni dal termociclatore e caricare con attenzione ciascuna miscela di reazione in ogni pozzetto del gel. Inoltre, caricare 10 µl di DNA length standard per la valutazione del peso molecolare. La corsa elettroforetica è fatta a V/cm (con elettrodi distanti 20 cm V circa), per min. Al termine della corsa, il gel viene immerso in una soluzione di etidio bromuro (EtBr) (circa 0.5 µg/ml di EtBr in H 2 O o buffer TBE) per minuti. In alternativa l EtBr (0.5 µg/ml) può essere aggiunto al buffer per l elettroforesi o al gel di agarosio. Se necessario, rimuovere l EtBr in eccesso immergendo il gel in H 2 O o buffer TBE 0.5 x per minuti. 4.5 Documentazione ed interpretazione Per la documentazione visualizzare il prodotto di amplificazione usando un transilluminatore UV ( nm) e fotografare con una macchina fotografica, un filtro e una pellicola adatti (per es. polaroid con pellicole 667). Scegliere i tempi di esposizione e di apertura in modo che le bande siano ben visibili e risaltino sullo sfondo scuro (per esempio apertura 11, tempo di esposizione 1 secondo). Per l interpretazione usare la tabella delle specificità ed il diagramma d interpretazione (vedere fogli aggiuntivi); sono da considerare positive solo le bande che hanno un peso molecolare corretto in confronto al ladder DNA standard. Le dimensioni corrette sono indicate nella tabella delle specificità e nel diagramma di interpretazione. Il controllo interno a 1070 bp / 429 bp deve essere chiaramente visibile nei pozzetti dove non c è amplificazione allele-specifica. In alcuni casi dove c è un amplificazione allele-specifica il controllo interno può essere più debole o scomparire completamente. Per risultati non corretti consultare la sezione Soluzione dei problemi (6). 9 di 12

10 Nel controllo di contaminazione non dovrebbe essere visibile alcuna banda. In caso di contaminazione con DNA genomico ci sarà una banda a 282 bp. Potrebbero esserci bande addizionali a 78 bp, 104 bp, 176 bp e 580 bp ca.. In caso di contaminazione con DNA amplificato ci sarà una banda a 78 bp e/o a104 bp e/o a 282 bp. 5. Avvertenze e precauzioni L etidio bromuro è un potente mutageno. Indossare i guanti quando si maneggiano gels o soluzioni contenenti EtBr! Fare riferimento alle istruzioni, alle avvertenze e alle precauzioni d uso del produttore! Il transilluminatore UV emette onde molto corte che possono causare bruciature alla pelle e alla retina. Usare una maschera per la protezione facciale UV! Tutti i materiali biologici impiegati per l estrazione del DNA, per es. sangue o tessuto umano, devono essere maneggiati come potenzialmente infetti. Si consigliano precauzioni di sicurezza appropriate quando si maneggiano materiali biologici (non pipettare con la bocca; indossare guanti monouso quando si maneggia materiale biologico e si esegue il test; al termine del test disinfettare le mani). Il materiale biologico deve essere inattivato prima dello smaltimento (per es. in autoclave). Il materiale smaltito deve essere autoclavato dopo l uso. La fuoriuscita di materiale potenzialmente infetto deve essere rimosso immediatamente con carta assorbente e le aree contaminate pulite con un disinfettante standard o con etanalo al 70%. Il materiale usato per pulire le fuoriuscite, incluso i guanti, deve essere inattivato prima dello smaltimento (per es. in autoclave). 10 di 12

11 6. Soluzione dei problemi Problema Possibile causa Soluzione nessuna amplificazione, DNA contaminato con inibitori di PCR ripetere l estrazione del DNA, length standard visibile provare metodi diversi concentrazione di DNA modificare la concentrazione di DNA / troppo alta / troppo bassa ripetere l estrazione di DNA enzima mancante ripetere la tipizzazione, o concentrazione troppo bassa modificare la concentrazione dell enzima DNA da sangue in eparina ripetere la tipizzazione con sangue in EDTA parametri di amplificazione errati ottimizzare i parametri di amplificazione (vedere 4.3) Ripetuto insuccesso in perdita nelle provette di reazione; chiudere bene le provette con i tappi; ciascun pozzetto (nessun evaporazione di acqua e variazione usare un altra provetta di reazione controllo di amplificazione) della concentrazione durante la PCR amplificazione a specifica, contaminazione con prodotti di ripetere la tipizzazione, bande addizionali, amplificazione assicurarsi dell esatta procedura del (bande addizionali di lavoro dimensioni errate devono DNA contaminato con sali ripetere l estrazione di DNA, essere tralasciate) provare metodi diversi concentrazione di DNA troppo alta usare meno DNA concentrazione dell enzima troppo alta usare meno enzima parametri di amplificazione errati ottimizzare i parametri di amplificazione (vedi 4.3) l interpretazione mostra più contaminazione carry-over (prodotti di controllare la Master Mix di 2 specificità amplificazione!) (senza aggiunta di DNA) nuovo allele assicurarsi dell esatta procedura del lavoro nessuna banda visibile o colorazione EtBr troppo debole ripetere la colorazione molto debole, length standard invisibile lo sfondo del gel è troppo colorazione troppo forte, immergere il gel in H 2 O o TBE per chiaro concentrazione di EtBr troppo alta diminuire la concentrazione di EtBr bande confuse buffer per elettroforesi troppo caldo diminuire il voltaggio errato buffer per elettroforesi usare buffer TBE 0,5 x Quando si usano i reagenti ed il materiale elencato, considerare come ultima risorsa l ottimizzazione dei parametri di amplificazione. In molti casi, è possibile interpretare il test eliminando le bande addizionali che hanno pesi molecolari non corretti. 11 di 12

12 7. Riferimenti 1. Bodmer, J., Immunogenetics 37: Olerup, O., Zetterquist H., Tissue Antigens 39: Olerup, O., Zetterquist H., Tissue Antigens 41: Lu, Y.H. and Négre, S., Trends in Genetics 9: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory 6. Beutler, E. et al., BioTechniques 9: Bunce, M., Tissue Antigens 46: Sacchetti et al., Clin Chem 43: Edwin Liu et al., 2005.Gastroenterology 128: Spiegazione dei simboli usati sulle etichette IVD For in vitro diagnostic use / Per uso dianogstico in vitro Storage temperature / Temperatura di conservazione LOT Batch code / Codice del lotto Use by / Utilizzare fino a.. REF Catalogue number / Numero di codice Consult instructions for use / Consultare le istruzioni d uso Per le istruzioni d'uso in altre lingue si veda: 12 di 12