AdnaTest BreastCancerSelect

Transcript

1 AdnaTest BreastCancerSelect Arricchimento di cellule tumorali dal sangue di pazienti con tumore della mammella per l analisi dell espressione genica Per uso diagnostico in vitro Manuale T-1-508

2 Indice generale Informazioni per gli ordini... 3 Scopo previsto... 3 Abbreviazioni e simboli... 4 Brevetti e marchi registrati... 4 Descrizione del prodotto... 5 Componenti del kit... 6 Ulteriori materiali necessari... 7 Conservazione... 8 Informazioni per l uso... 8 Avvertenze e precauzioni per l uso diagnostico in vitro Protocollo A. Preparazione delle Biglie BreastSelect B. Selezione delle cellule tumorali Caratteristiche prestazionali Manuale breve

3 Informazioni per gli ordini Le informazioni per gli ordini sono disponibili su e Inoltre il team di supporto di QIAGEN Hannover è a disposizione per rispondere a qualsiasi domanda riguardante i kit AdnaTest (support@adnagen.com). Scopo previsto Il kit è stato sviluppato per l arricchimento delle cellule tumorali circolanti (CTC) dal sangue periferico di pazienti con tumore della mammella ed è destinato all uso diagnostico in vitro. Il kit AdnaTest BreastCancerDetect è consigliato per la successiva analisi dell espressione genica associata al tumore della mammella. 3

4 Abbreviazioni e simboli AdnaMag-L AdnaMag-S bp cdna DNA mrna PCR RNasi rpm RT Concentratore di particelle magnetiche (L = large, grande) Concentratore di particelle magnetiche (S = small, piccolo) Coppie di basi Acido deossiribonucleico complementare Acido deossiribonucleico Acido ribonucleico messaggero Reazione a catena della polimerasi Ribonucleasi Giri al minuto Trascrizione inversa Utilizzare entro la data indicata Limite di temperatura Numero di catalogo Fare riferimento alle informazioni fornite nel manuale Produttore Dispositivo medico-diagnostico in vitro Brevetti e marchi registrati Dynabeads è un marchio registrato di Invitrogen and Life Technologies Corporation. 4

5 Descrizione del prodotto Il kit consente l arricchimento immunomagnetico delle cellule tumorali tramite antigeni epiteliali e associati al tumore. Gli anticorpi contro gli antigeni epiteliali e associati al tumore vengono coniugati con le biglie magnetiche (Dynabeads ) per marcare le cellule tumorali nel sangue periferico. Le cellule marcate vengono estratte da un concentratore di particelle magnetiche (AdnaMag-L e AdnaMag-S) e successivamente vengono sottoposte a lisi (Figura 1). Il lisato cellulare è utilizzato per eseguire ulteriori analisi (si consiglia di proseguire con il kit AdnaTest BreastCancerDetect). Biglie BreastSelect Incubazione Separazione Lisi cellulare RNA Purificazione dell mrna con biglie magnetiche rivestite di Oligo(dT) 25 Trascrizione inversa Cellule ematiche Cellule tumorali RNA RNA cdna Biglie magnetiche rivestite di anticorpi o Oligo(dT) 25 AdnaTest BreastCancerDetect Figura 1. Schema della preparazione dei campioni 5

6 Componenti del kit Il kit include i componenti seguenti: Tabella 1. Componenti del kit Componente Simbolo T (12 test) BreastSelect Beads (Biglie BreastSelect) Lysis/Binding Buffer (Tampone di legame/lisi)

7 Ulteriori materiali necessari Attrezzatura: Rotatore per provette da 15 ml e 1,5 ml Concentratori di particelle magnetiche AdnaMag-L (QIAGEN Hannover GmbH, n. cat. T-1-700) AdnaMag-S (QIAGEN Hannover GmbH, n. cat. T-1-800) Materiale: Pipette di plastica o vetro da 10 ml sterili, prive di RNasi e pipettatore Provette di reazione da 1,5 ml, sterili, prive di RNasi (ad es. Sarstedt, n. cat ) Provette da 15 ml (utilizzare provette in polipropilene sterili, prive di RNasi, ad es. Sarstedt, n. cat ) Pipette e puntali privi di RNasi, provvisti di barriera antiaerosol, idonei per pipettare volumi tra 100 µl e 1000 µl Guanti e occhiali di protezione Reagenti: Tampone fosfato salino (PBS), ph 7,0-7,3 (ad es. Fisher, n. cat. VX , D-PBS) 7

8 Conservazione Il kit deve essere conservato a 4-8 C. Non utilizzare nessun componente oltre la data di scadenza. Informazioni per l uso Nel caso la confezione esterna o i singoli componenti del kit appaiano danneggiati, contattare il supporto tecnico QIAGEN (per le informazioni sui contatti, visitare Il test deve essere eseguito da personale competente nelle tecniche di biologica molecolare. Preparazione del campione: I campioni di sangue devono essere prelevati prima dell assunzione di sostanze terapeutiche. Non utilizzare il kit AdnaTest se non sono trascorsi 7 giorni dall ultimo intervento terapeutico! Prelievo del sangue: utilizzare soltanto provette per prelievo ematico AdnaCollect (n. cat. T-1-600, QIAGEN Hannover GmbH) o provette per prelievo ematico contenenti l anticoagulante EDTA (ad es. S Monovette Kalium EDTA, Sarstedt; BD Vacutainer K3EDTA, Becton Dickinson), prelevando almeno 5 ml di sangue intero. Non utilizzare eparina o citrato. Conservare immediatamente il sangue a 4-8 C. 8

9 I campioni devono essere trattati il prima possibile e comunque entro 4 ore dal prelievo del sangue se si utilizzano provette con EDTA oppure entro 24 ore se si utilizzano provette AdnaCollect. Il campione di sangue non deve essere emolizzato. Manipolazione: Le Biglie BreastSelect 1 contengono azoturo di sodio come conservante. L azoturo di sodio è citotossico, pertanto deve essere rimosso prima di utilizzare le biglie. Tutti i componenti e i reagenti supplementari procurati da altri fornitori devono essere conservati secondo le rispettive istruzioni. Sono valide le indicazioni sulla sicurezza fornite dai rispettivi produttori. Indossare guanti di protezione per evitare la contaminazione con DNA, RNA e RNasi. Aliquotare le Biglie BreastSelect per evitare la contaminazione. Il test deve essere eseguito nella sequenza descritta e deve essere conforme a tutte le specifiche dichiarate rispetto a tempi e temperature di incubazione. Scartare i campioni in caso di agglutinazione delle biglie durante l arricchimento cellulare. Le procedure di trattamento dei campioni, tra cui la trascrizione inversa e la successiva analisi dei prodotti della PCR amplificati, devono essere eseguite preferibilmente in stanze diverse per evitare contaminazioni crociate. 9

10 L uso di prodotti di fornitori diversi da quelli consigliati può causare risultati di qualità inferiore. Avvertenze e precauzioni per l uso diagnostico in vitro Durante la manipolazione di sostanze chimiche, è opportuno indossare sempre un camice da laboratorio, guanti monouso e occhiali protettivi. Per maggiori informazioni, consultare le schede di sicurezza sul prodotto (SDS). Le schede sono disponibili online nel pratico formato PDF sul sito dove è possibile cercare, visualizzare e stampare la scheda SDS di ogni kit e di ogni componente del kit QIAGEN. Smaltire campioni e materiali di scarto nel rispetto delle procedure di sicurezza locali. 10

11 Protocollo A. Preparazione delle Biglie BreastSelect È necessario rimuovere l azoturo di sodio lavando le Biglie BreastSelect prima dell uso: 1. Risospendere le Biglie BreastSelect 1 pipettando con cura; non agitare in vortex! 2. Calcolare il volume delle Biglie BreastSelect 1 necessarie per tutti i campioni da trattare (100 µl per campione) e trasferire il volume calcolato in una provetta di reazione da 1,5 ml. Se vengono trattati più di 10 campioni, utilizzare altre provette di reazione da 1,5 ml. 3. Posizionare la provetta nell AdnaMag-S. 4. Dopo 1 minuto, rimuovere il sopranatante con una pipetta. Importante per ogni procedura: non toccare le biglie durante la rimozione dei sopranatanti! 5. Lavaggio a. Rimuovere la guida magnetica dall AdnaMag-S. b. Aggiungere 1 ml di tampone PBS e risospendere le biglie con pipettamenti ripetuti. c. Posizionare la guida magnetica nell AdnaMag-S. d. Dopo 1 minuto, rimuovere tutto il sopranatante con una pipetta. Ripetere due volte (tre lavaggi in totale). 11

12 6. Rimuovere la provetta dall AdnaMag-S e risospendere le biglie nel tampone PBS fino al volume originale (100 µl per campione). B. Selezione delle cellule tumorali 1. Pipettare 5 ml di un campione di sangue in una provetta da 15 ml (utilizzare soltanto le provette per prelievo ematico approvate; vedere pagina 8). 2. Risospendere con cura le Biglie BreastSelect (preparate al passaggio A6) pipettandole e aggiungendone 100 µl in ogni campione di sangue. 3. Ruotare le provette lentamente (circa 5 rpm) per 30 minuti a temperatura ambiente su un dispositivo che esegue movimenti rotatori e basculanti. 4. Posizionare le provette nell AdnaMag-L senza la guida magnetica. Fare oscillare l AdnaMag-L verso il basso per liberare le gocce di sangue catturate nel tappo. 5. Inserire la guida magnetica e incubare le provette nell AdnaMag-L per 3 minuti a temperatura ambiente. 6. Nel frattempo equilibrare il Tampone di legame/lisi 2 a temperatura ambiente. Nota: verificare che il Tampone di legame/lisi non contenga precipitati. In presenza di un precipitato, equilibrare il tampone a temperatura ambiente e miscelarlo fino al completo scioglimento. 7. Rimuovere tutto il sopranatante ematico con una pipetta da 10 ml, senza toccare le biglie. 12

13 8. Lavaggio a. Rimuovere la guida magnetica dall AdnaMag-L. b. Aggiungere 5 ml di tampone PBS, chiudere le provette e agitare delicatamente l AdnaMag-L in avanti e indietro per 5 volte, in modo da risospendere i complessi biglia magnetica/cellula. c. Fare oscillare l AdnaMag-L con le provette verso il basso per due volte, in modo da liberare le gocce catturate nel tappo. d. Posizionare la guida magnetica nell AdnaMag-L e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente. e. Rimuovere tutto il sopranatante con una pipetta. Ripetere due volte (tre lavaggi in totale). 9. Rimuovere la guida magnetica dall AdnaMag-L. 10. Risospendere i complessi biglia magnetica/cellula in 1 ml di tampone PBS e trasferire ogni campione in una provetta di reazione da 1,5 ml. 11. Posizionare le provette di reazione nell AdnaMag-S con una guida magnetica inserita. Nota: la guida magnetica dell AdnaMag-S può essere inserita in due posizioni. Inserire sempre la guida con la pellicola di plastica bianca rivolta in avanti per assicurare che i magneti siano vicini alle provette di reazione. 12. Dopo 1 minuto, rimuovere i sopranatanti completamente con una pipetta per ottimizzare la lisi cellulare successiva! 13. Rimuovere la guida magnetica dall AdnaMag-S. 13

14 14. Aggiungere 200 µl di Tampone di legame/lisi 2 (equilibrato a temperatura ambiente) in ogni provetta di reazione. Risospendere pipettando almeno cinque volte. 15. Inserire la guida magnetica nell AdnaMag-S e incubare per 1 minuto. 16. Trasferire i sopranatanti (lisati cellulari) in nuove provette di reazione da 1,5 ml. 17. Scartare le provette con le biglie. 18. Proseguire immediatamente con l estrazione dell mrna (AdnaTest BreastCancerDetect) o conservare i lisati cellulari a non più di -20 C per 2 settimane al massimo. Caratteristiche prestazionali Per le caratteristiche prestazionali del kit AdnaTest BreastCancer- Select, vedere 14

15 Manuale breve Componenti BreastSelect Beads (Biglie BreastSelect) Lysis/Binding Buffer (Tampone di legame/lisi) 1 2 Occorrente per ogni campione 5 ml di sangue intero (per i dettagli, vedere pagina 8) 1 provetta da 15 ml 2 provette di reazione da 1,5 ml Pipette di plastica o vetro da 10 ml (prive di RNasi) e pipettatore Pipette da µl e puntali (privi di RNasi) Protocollo Risospendere con cura le Biglie BreastSelect 1 e trasferire 100 µl per ogni campione di sangue in una provetta di reazione da 1,5 ml. Lavare le Biglie BreastSelect con 3 1 ml di tampone PBS. Risospendere le Biglie BreastSelect in 100 µl di tampone PBS per campione di sangue. Trasferire 5 ml di sangue intero in una provetta da 15 ml. Aggiungere 100 µl di Biglie BreastSelect lavate in ogni campione di sangue. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con movimenti rotatori e basculanti a circa 5 rpm. 15

16 Posizionare la provetta nell AdnaMag-L per 3 minuti per separare le biglie. Liberare tutte le gocce di sangue catturate nel tappo facendo oscillare l AdnaMag-L verso il basso. Rimuovere il sopranatante ematico. Lavare le biglie con 3 5 ml di tampone PBS. Risospendere le biglie in 1 ml di tampone PBS e trasferirle in una provetta di reazione da 1,5 ml. Separare le biglie nell AdnaMag-S e rimuovere il sopranatante. Risospendere le biglie in 200 µl di Tampone di legame/lisi 2 pipettando almeno cinque volte. Posizionare le provette di reazione nell AdnaMag-S e trasferire il sopranatante in una nuova provetta di reazione. Proseguire immediatamente con il kit AdnaTest BreastCancer- Detect o conservare a non più di -20 C per 2 settimane al massimo. 16

17 HB-2110-IT-001 QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse 1 D Hilden GERMANIA Per richiedere assistenza Tel.: +49 (0) Fax: +49 (0) support@adnagen.com Internet: e