TOSCANA VIRUS oligomix Alert kit reagente per l amplificazione "nested" del cdna

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1 SOMMARIO USO PREVISTO pag. 1 PRESENTAZIONE DEL KIT pag. 1 CARATTERISTICHE DEL KIT pag. 2 ALTRI PRODOTTI RICHIESTI pag. 2 MATERIALE INCLUSO NEL KIT pag. 2 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL KIT pag. 2 AVVERTENZE E PRECAUZIONI pag. 3 PROCEDURA pag. 4 BIBLIOGRAFIA pag. 7 PROBLEMI E SOLUZIONI pag. 8 LEGENDA DEI SIMBOLI pag. 9 USO PREVISTO Il kit trova impiego nella ricerca del cdna di Toscana virus nel prodotto della reazione di trascrizione inversa ottenuto dall RNA estratto da campioni di sangue collezionato in EDTA, plasma collezionato in EDTA, liquido cefalorachidiano o campioni respiratori. La ricerca del cdna del Toscana virus con un saggio di amplificazione può essere utilizzata per l'accertamento dell'infezione nei casi di sospetta patologia da Toscana virus. PRESENTAZIONE DEL KIT ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com sito WEB: C Il kit fornisce le miscele di reazione OligoMIX per la prima e per la seconda amplificazione, già prealiquotate in provette «monotest» pronte all'uso. La procedura prevede l'esecuzione di due successive reazioni di amplificazione (nested) specifiche per la regione genomica codificante per la proteina N di Toscana virus utilizzando il prodotto della reazione di trascrizione inversa ottenuto dall RNA estratto dai campioni in esame. La presenza del prodotto specifico della seconda reazione di amplificazione indica la presenza del cdna di Toscana virus nel prodotto della reazione di trascrizione inversa. SCH mban071 28/05/13 Revisione 02 Pag. 1/9 CARATTERISTICHE DEL KIT La sensibilità della reazione permette di rivelare la presenza di circa 10 molecole di DNA bersaglio (pari a circa dieci cdna del genoma virale) nei 10 µl di prodotto della reazione di trascrizione inversa aggiunti alla provetta «monotest». Nota bene: se si estraggono 300 µl di liquido cefalorachidiano con il kit «EXTRAgen» (vedi paragrafo successivo sui kit accessori) e si esegue la reazione di trascrizione inversa con il kit «RT - kit plus» (vedi paragrafo successivo sui kit accessori) la sensibilità della metodica è pari a circa 200 virus / ml. Nota bene: se si estraggono 200 µl di campione respiratorio con il kit «EXTRAzol» (vedi paragrafo successivo sui kit accessori) e si esegue la reazione di trascrizione inversa con il kit «RT - kit plus» (vedi paragrafo successivo sui kit accessori) la sensibilità della metodica è pari a circa 300 virus / ml. Il kit consente di effettuare 50 reazioni, controlli positivi e negativi compresi. ALTRI PRODOTTI RICHIESTI I reagenti per l'estrazione dell RNA dai campioni da analizzare, per la trascrizione inversa dell RNA per il controllo di amplificazione, per il controllo interno di qualità e per la rivelazione del DNA amplificato non sono inclusi in questo kit. Per eseguire queste fasi analitiche si consiglia l impiego dei seguenti prodotti fabbricati da ELITechGroup S.p.A.: «EXTRAgen» (codice EXTG01), kit di estrazione degli acidi nucleici da campioni non cellulari; il kit consente di effettuare 50 estrazioni. «EXTRAzol» (codice EXTR01), kit di estrazione dell RNA da campioni cellulari; il kit consente di effettuare 50 estrazioni. «RT - kit plus» (codice BRK200), kit di trascrizione inversa dell RNA con random primer ; il kit consente di effettuare 50 reazioni. «TOSCANA VIRUS - Positive Control» (codice CTR071), controllo di amplificazione di DNA plasmidico; il prodotto consente di effettuare 25 reazioni. «DNA polymerase 2U / µl» (codice ER140), enzima DNA polimerasi termostabile per l'amplificazione degli acidi nucleici; il prodotto consente di effettuare 100 reazioni. «RECK» (codice RK100), controllo interno di qualità che utilizza il «CPE-RNA» come standard; il prodotto consente di effettuare 100 reazioni. «ELECTROPHORESIS 2» (codice EPH02), rivelazione del DNA amplificato per elettroforesi su gel di agaroso; il kit consente di effettuare 64 rivelazioni. MATERIALE INCLUSO NEL KIT Componente Descrizione Quantità Composizione Etichettatura OligoMIX di prima amplificazione OligoMIX di seconda amplificazione miscela di amplificazione in provette NEUTRE da 0,2 o 0,5 ml miscela di amplificazione in provette ROSSE da 0,2 o 0,5 ml 50 x 85 µl 50 x 94 µl Oligonucleotidi esterni, Cloruro di potassio, TRIS base, TRIS cloridrato, Triton X-100, Cloruro di magnesio, Desossinucleotidi trifosfati, olio di vaselina Oligonucleotidi interni, Cloruro di potassio, TRIS base, TRIS cloridrato, Triton X-100, Cloruro di magnesio, Desossinucleotidi trifosfati, olio di vaselina MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL KIT - Cappa a flusso laminare. - Guanti monouso in lattice o simili. - Microcentrifuga da banco ( RPM). - Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl). - Acqua bidistillata sterile. - Termostato programmabile (thermal - cycler). SCH mban071 28/05/13 Revisione 02 Pag. 2/9 - -

2 AVVERTENZE E PRECAUZIONI Questo kit è riservato esclusivamente all'uso in vitro. Avvertenze e precauzioni generali Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno 30 minuti oppure trattato in autoclave a 121 C per un'ora prima di essere smaltito. Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere neutralizzati prima dell'eliminazione. Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi o la faccia. Non pipettare a bocca alcuna soluzione. Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro. Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti. Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti. Leggere tutte le istruzioni fornite nel kit prima di eseguire il saggio. Attenersi alle istruzioni fornite nel kit durante l'esecuzione del saggio. Rispettare la data di scadenza del kit. Utilizzare solo i reagenti presenti nel kit e quelli consigliati dal produttore. Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi. Non utilizzare reagenti provenienti da kit di altri produttori. Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici, richiedono personale addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni da parte di prodotti di amplificazione. E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai introdurre un prodotto di amplificazione nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai trasferire camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione all'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai essere aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso. Avvertenze e precauzioni specifiche per i componenti Le provette contenenti le OligoMIX per la prima amplificazione e per la seconda amplificazione sono monouso e pertanto devono essere utilizzate una volta sola in reazioni di amplificazione. Le OligoMIX per la prima amplificazione e per la seconda amplificazione presentano i seguenti consigli di prudenza (S): S Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi. Impostazione del ciclo termico PROCEDURA - verificare che il blocco termico del termostato programmabile (thermal - cycler, T.C.) sia compatibile con il formato delle provette «monotest» fornite nel kit (provette da 0,2 o 0,5 ml); - verificare sulla documentazione dello strumento la modalità di controllo della temperatura che il thermal - cycler adotta per l'esecuzione del ciclo termico; - quando possibile, selezionare la modalità di controllo della temperatura direttamente sul blocco termico (per esempio thermal - cycler Hybaid TM o Eppendorf TM ): non utilizzare la modalità di controllo della temperatura mediante provetta-sonda o con software di simulazione; - quando non è possibile e per i thermal - cycler GeneAmp PCR System 9600, 2400, 9700 o 2700 (Applied Biosystems TM ) utilizzare la modalità di controllo della temperatura predefinita; - impostare sul thermal - cycler i parametri del ciclo termico descritti nella tabella seguente. Ciclo termico della prima amplificazione Numero di cicli Temperature Tempi 1 ciclo 95 C 4 min. 35 cicli Ciclo termico della seconda amplificazione Campioni 95 C 1 min. 55 C 1 min. 72 C 1 min. 1 ciclo 72 C 5 min. Numero di cicli Temperature Tempi 1 ciclo 95 C 2 min. 30 cicli 95 C 1 min. 55 C 1 min. 72 C 1 min. 1 ciclo 72 C 5 min. Il materiale da utilizzare con questo kit deve essere costituito dal prodotto della reazione di trascrizione inversa (cdna) ottenuto dall RNA estratto da campioni biologici. Il sistema di trascrizione inversa dell'rna deve utilizzare i "random primer" per l'innesco della reazione di polimerizzazione. SCH mban071 28/05/13 Revisione 02 Pag. 3/9 SCH mban071 28/05/13 Revisione 02 Pag. 4/9

3 Quando si impiegano campioni biologici cellulari, per esempio sangue intero, si consiglia di verificare la quantità di RNA totale estratto che è immessa nella reazione di trascrizione inversa, per evitare la comparsa di prodotti aspecifici e possibili fenomeni di inibizione nella successiva reazione di amplificazione. La concentrazione finale massima dell RNA totale nella reazione di trascrizione inversa dovrebbe essere di circa 40 ng / µl. Per esempio, la quantità massima di RNA totale che può essere immessa in una reazione di trascrizione inversa con volume finale di 25 µl è di circa 1 µg. Il sistema di estrazione dell'rna dal campione di partenza deve fornire RNA idoneo all'uso in reazioni di trascrizione inversa ed amplificazione. Si consiglia di allestire più aliquote dei campioni da conservare congelate in modo da non sottoporle a cicli di congelamento / scongelamento ripetuti. Controlli di amplificazione E' assolutamente necessario convalidare ciascuna sessione di amplificazione allestendo una reazione di controllo negativo e una reazione di controllo. Per il controllo negativo utilizzare acqua bidistillata sterile (non fornita nel kit) da aggiungere alla reazione al posto del cdna ottenuto dal campione. Per il controllo utilizzare il prodotto «TOSCANA VIRUS - Positive Control». Allestimento della prima amplificazione - scongelare i campioni da analizzare e il controllo, centrifugarli per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerli in ghiaccio. - scongelare una provetta «monotest» neutra per ciascuno dei campioni da analizzare, una per il controllo negativo ed una per il controllo, centrifugarle per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto, marcarle in modo riconoscibile con un pennarello indelebile e tenerle in ghiaccio. - diluire come descritto nella tabella seguente l'enzima «DNA pol. 2U / µl» con «RECK». Preparare un volume di enzima diluito sufficiente per tutte le reazioni previste (controlli compresi) più una, per avere un margine di sicurezza. L enzima diluito non può essere conservato. Numero di reazioni DNA pol. 2U / µl RECK Volume totale 4 2,0 µl 18,0 µl 20 µl 5 2,5 µl 22,5 µl 25 µl 6 3,0 µl 27,0 µl 30 µl 7 3,5 µl 31,5 µl 35 µl 8 4,0 µl 36,0 µl 40 µl 9 4,5 µl 40,5 µl 45 µl 10 5,0 µl 45,0 µl 50 µl 11 5,5 µl 49,5 µl 55 µl 12 6,0 µl 54,0 µl 60 µl 13 6,5 µl 58,5 µl 65 µl 14 7,0 µl 63,0 µl 70 µl 15 7,5 µl 67,5 µl 75 µl 16 8,0 µl 72,0 µl 80 µl 17 8,5 µl 76,5 µl 85 µl 18 9,0 µl 81,0 µl 90 µl 19 9,5 µl 85,5 µl 95 µl 20 10,0 µl 90,0 µl 100 µl 21 10,5 µl 94,5 µl 105 µl 1. Aggiungere a ciascuna provetta «monotest» neutra 5 µl di DNA polimerasi termostabile diluita (1 U). 2. Aggiungere a ciascuna provetta «monotest» neutra 10 µl di cdna. Procedere nello stesso modo con il controllo negativo e con il controllo. 3. Trasferire le provette «monotest» neutre nel thermal - cycler e avviare il ciclo termico della prima amplificazione. Allestimento della seconda amplificazione - scongelare tante provette «monotest» rosse quante sono quelle neutre, centrifugarle per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto, marcarle in modo riconoscibile con un pennarello indelebile e tenerle in ghiaccio. - diluire l'enzima «DNA pol. 2U / µl» con il «RECK», come descritto precedentemente. 4. Aggiungere a ciascuna provetta «monotest» rossa 5 µl di DNA polimerasi termostabile diluita (1 U). 5. Aggiungere a ciascuna provetta «monotest» rossa 1 µl di prodotto della prima amplificazione. Nota bene: Il prodotto della prima amplificazione è in grado di contaminare i saggi successivi. Confinare il prodotto della prima amplificazione residuo e cambiare i guanti alla fine di questa fase della procedura. 6. Trasferire le provette «monotest» rosse nel thermal - cycler e avviare il ciclo termico della seconda amplificazione. Nota bene: Il prodotto di reazione può essere conservato a -20 C per un massimo di un mese. Rivelazione del prodotto specifico di amplificazione Il prodotto specifico della seconda amplificazione può essere rivelato ed identificato mediante separazione elettroforetica nelle condizioni descritte di seguito: - utilizzando un gel d'agaroso al 2% con bromuro di etidio 1 µg / ml in tampone TBE 1x (89 mm TRIS, 89 mm acido borico, 2 mm EDTA disodico); - utilizzando un gel d'agaroso al 4% con bromuro di etidio 1 µg / ml in tampone TAE 1x (40 mm TRIS, 20 mm acido acetico, 1 mm EDTA disodico), come nei prodotti della serie «ELECTROPHORESIS». Il prodotto specifico della seconda amplificazione ha dimensioni di 310 bp. Nota bene: Il prodotto della seconda amplificazione è in grado di contaminare i saggi successivi. Confinare il prodotto della seconda amplificazione residuo e gli scarti prodotti nella fase di rivelazione. A titolo di esempio, è riportata di seguito una figura schematica che rappresenta il risultato della separazione elettroforetica di una sessione di amplificazione in cui sono stati analizzati due campioni. Pozzetti 1380 bp Pesi Molecolari Controllo Controllo negativo Campione Campione negativo 517 bp ( *) ( *) 456 bp (610 bp*) (610 bp*) 396 bp 247 bp 310 bp 310 bp 75 bp 65 bp 46 bp Pesi Molecolari * Quando si utilizza il sistema di controllo interno di qualità «RECK», i campioni negativi per il prodotto di amplificazione di Toscana virus presentano, se idonei, il prodotto di amplificazione del «CPE-RNA - Internal Control» di dimensioni di circa 610 bp. Inoltre, con il «RECK», anche i campioni positivi per il prodotto di amplificazione di Toscana virus possono presentare il prodotto di amplificazione del «CPE-RNA - Internal Control». SCH mban071 28/05/13 Revisione 02 Pag. 5/9 SCH mban071 28/05/13 Revisione 02 Pag. 6/9

4 E' assolutamente necessario convalidare la specificità del prodotto della seconda amplificazione di un campione confrontando la sua migrazione su gel con la migrazione di un marker di peso molecolare e con la migrazione del prodotto della seconda amplificazione del controllo. L'eventuale presenza di prodotti aspecifici della seconda amplificazione di un campione non ha alcun significato per quanto riguarda la ricerca del cdna di Toscana virus. Convalidazione generale della sessione di amplificazione I risultati delle reazioni di controllo negativo e di controllo sono utilizzati per convalidare la sessione di amplificazione come descritto nelle tabelle seguenti: Amplificazione del controllo negativo Prodotto specifico ASSENTE Amplificazione del controllo Prodotto specifico PRESENTE Amplificazione corretta Amplificazione corretta Se il prodotto specifico di amplificazione è presente nella reazione di controllo negativo, si sono verificati problemi nella fase di amplificazione (contaminazione) che possono causare risultati falsi positivi, il saggio deve essere ripetuto a partire dalla fase di amplificazione. Se il prodotto specifico di amplificazione è assente nella reazione di controllo, si sono verificati problemi nella fase di amplificazione (amplificazione non efficiente o assente) che possono causare risultati falsi negativi, il saggio deve essere ripetuto a partire dalla fase di amplificazione. Interpretazione dei risultati I risultati delle reazioni relative ai campioni in analisi sono utilizzati per valutare la presenza del cdna di Toscana virus come descritto nelle tabelle seguenti: Amplificazione del campione Risultato del saggio cdna di Toscana virus Prodotto specifico ASSENTE negativo ASSENTE Prodotto specifico PRESENTE PRESENTE Prima di convalidare definitivamente il risultato "cdna di Toscana virus ASSENTE" per un campione in analisi è necessario esaminare la possibilità che si siano verificati problemi nella fase di amplificazione (amplificazione non efficiente o assente), nella fase di trascrizione inversa (trascrizione inversa non efficiente o assente) o nella fase di estrazione (perdita dell'rna, presenza di inibitori, RNA del campione degradato o campione di partenza con un numero di cellule insufficiente). In questi casi un campione potrebbe essere non idoneo e causare un risultato falso negativo. L'idoneità dei campioni può essere accertata usando un sistema di controllo interno di qualità come il «RECK». PROBLEMI E SOLUZIONI Prodotto specifico di amplificazione presente nella reazione di controllo negativo Errore durante la dispensazione del cdna prima amplificazione Contaminazione dei reagenti preparati per la sessione Contaminazione dell'acqua sterile per la diluizione dell'enzima Contaminazione dello stock di enzima Contaminazione dell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione Aprire una provetta per volta, evitare di spargere il contenuto della provetta, cambiare sempre puntale Aprire una provetta per volta, evitare di spargere il contenuto della provetta, cambiare sempre puntale Seguire con attenzione la diluizione e la dispensazione dell'enzima, cambiare sempre puntale Utilizzare una nuova aliquota di acqua sterile Utilizzare una nuova aliquota di enzima Pulire superfici e strumenti con detergenti acquosi, lavare camici, sostituire provette e puntali in uso Prodotto specifico di amplificazione assente nella reazione del Positive Control Enzima troppo diluito o errore durante la dispensazione dell' enzima Errore durante la dispensazione del controllo Degradazione del controllo Errore di impostazione del ciclo termico prima amplificazione seconda amplificazione nel gel Ricontrollare i calcoli di diluizione, seguire con attenzione la dispensazione dell'enzima e mescolare adeguatamente Seguire con attenzione la dispensazione del controllo Utilizzare una nuova aliquota di controllo Controllare il ciclo termico impostato sul thermal cycler Prodotti aspecifici di amplificazione presenti nelle reazioni dei campioni Prelevare e dispensare con attenzione il prodotto di prima amplificazione nella seconda amplificazione Caricare con attenzione il prodotto della seconda amplificazione nel gel BIBLIOGRAFIA M. Valassina et al. (1996) J. Clin. Microbiol. 34: Enzima troppo concentrato Ricontrollare i calcoli di diluizione dell'enzima Tempi di allestimento della prima reazione di amplificazione troppo lunghi Tenere in ghiaccio le provette a cui si è già aggiunto il cdna fino al trasferimento sul thermal cycler Errore di impostazione del ciclo termico Eccesso di cdna nella reazione Controllare il ciclo termico impostato sul thermal cycler Valutare la concentrazione dell RNA presente nella reazione di trascrizione inversa, non superare una concentrazione di 40 ng / µl (1 µg di RNA in una reazione da 25 µl finali) SCH mban071 28/05/13 Revisione 02 Pag. 7/9 SCH mban071 28/05/13 Revisione 02 Pag. 8/9

5 LEGENDA DEI SIMBOLI Numero di catalogo. Limite superiore di temperatura. Codice del lotto. Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese). Dis medico diagnostico in vitro. Co Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici diagnostici in vitro. Contenuto sufficiente per "N" test. CONT Contenuto. Attenzione, consultare le istruzioni per l uso. Produttore. SCH mban071 28/05/13 Revisione 02 Pag. 9/9