AVVERTENZA del 18/06/15. «EXTRAcell» cod. EXTD02

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1 AVVERTENZA del 18/06/15 IMPORTANTE PER GLI UTILIZZATORI DEL PRODOTTO: cod. ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: sito WEB: Sono state apportate delle modifiche al Manuale d Istruzioni per l Uso (IFU), SCH m, riguardanti la classificazione e l etichettatura delle sostanze/miscele contenute nel kit, come previsto dal Regolamento n. 1272/2008 (CLP) e s.m.i. Tutte le modifiche introdotte sono riportate dettagliatamente nel Manuale d Istruzioni per l Uso (IFU) allegato e nelle Schede dati di Sicurezza relative al prodotto. Il principio analitico e i reattivi del test restano del tutto invariati. NOTA BENE LA REVISIONE DI QUESTO IFU E COMPATIBILE ANCHE CON LA VERSIONE PRECEDENTE DEL KIT (vedi Package Insert incluso nel kit) THE REVIEW OF THIS IFU IS ALSO COMPATIBLE WITH THE PREVIOUS VERSION OF THE KIT (see Package Insert included in the kit) CET IFU MIS A JOUR ANNULE ET REMPLACE ET EST PARFAITEMENT COMPATIBLE AVEC LA VERSION PRECEDENTE DU KIT (voir Package Insert inclus dans le kit) LA REVISIÓN DE ESTE IFU ES COMPATIBLE TAMBIÉN CON LA VERSIÓN ANTERIOR DEL KIT (véa Package Insert incluido en el kit) A REVISÃO DO ESTE IFU ÉTAMBÉM COMPATÍVEL COM A VERSÃO ANTERIOR DO KIT (ver Package Insert incluído no kit) DIE REVIEW VON DIESER IFU IST KOMPATIBLE MIT DER VORIGE VERSION VON DEM TEST-KIT (Sehen Sie Package Insert im Kit enthalten) Accessori e kit degli strumenti Strumenti per l estrazione automatica e l amplificazione si accompagnano all utilizzo di accessori e/o kit indicati nel Manuale d Istruzione per l Uso nella sezione Altri prodotti richiesti. La richiesta di tali prodotti deve essere espressamente indicata nell ordine d acquisto relativo al presente kit di amplificazione. Avvertenza nr. SCH m_04 del 18/06/15

2 SOMMARIO USO PREVISTO pag. 1 PRINCIPIO DELLA METODICA pag. 2 DESCRIZIONE DEL KIT pag. 2 MATERIALE INCLUSO NEL KIT pag. 2 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL KIT pag. 3 ALTRI PRODOTTI RICHIESTI pag. 3 AVVERTENZE E PRECAUZIONI pag. 3 CAMPIONI E CONTROLLI pag. 5 PROCEDURE pag. 6 LIMITI DELLA PROCEDURA pag. 14 CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI pag. 15 BIBLIOGRAFIA pag. 16 PROBLEMI E SOLUZIONI pag. 17 LEGENDA DEI SIMBOLI pag. 18 USO PREVISTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com sito WEB: +2 C +8 C Il prodotto è un sistema di estrazione del DNA cellulare e virale contenuto nelle cellule eucariote e procariote presenti in campioni cellulari quali sangue intero (periferico e midollare), leucociti periferici, linfomonociti, granulociti, prelievi cervicali, tamponi uretrali, tamponi faringei, tamponi nasali, lavaggio bronco-alveolare, escreato, saliva, gargarizzato, liquido amniotico, urine e liquido cefalorachidiano. Il prodotto trova impiego nell'estrazione del DNA da campioni cellulari. Il DNA può essere utilizzato per saggi diagnostici basati sull'amplificazione degli acidi nucleici con gli enzimi DNA polimerasi (per esempio DNA polimerasi termostabili). PRINCIPIO DELLA METODICA Il prodotto è una metodica di estrazione del DNA con lisi alcalina ad alta temperatura. La procedura prevede tre fasi operative: - la lisi del campione ad alta temperatura (circa 5 minuti) con una base (idrossido di potassio); - l'eliminazione degli inibitori ad alta temperatura (circa 10 minuti) per chelazione e adsorbimento su una resina (Chelex 100); - la neutralizzazione del lisato (circa 1 minuto) con un tampone (TRIS cloridrato). DESCRIZIONE DEL KIT Il kit fornisce i seguenti componenti: - il reagente di preparazione dei campioni Lysis Buffer 10x, 40 ml di soluzione da ricostituire con l'aggiunta di 360 ml di acqua bidistillata sterile, - il reagente di preparazione dei campioni Cell Buffer 10x, 40 ml di soluzione da ricostituire con l'aggiunta di 360 ml di acqua bidistillata sterile, - le Microprovette di Estrazione, 50 provette da 0,5 ml per biologia molecolare, - il reagente di estrazione Talc Buffer, 3 ml di soluzione pronta all'uso, - il reagente di estrazione Resina, 3 ml di soluzione pronta all'uso, - il reagente di estrazione Neutral Buffer, 3 ml di soluzione pronta all'uso, - l'acqua Ultrapura, per biologia molecolare, prealiquotata in 9 provette contenenti 1,9 ml. Il kit consente di effettuare 50 estrazioni, controlli positivi e negativi compresi. MATERIALE INCLUSO NEL KIT Componente Descrizione Quantità Composizione Etichettatura Lysis Buffer 10x Cell Buffer 10x Microprovette di Estrazione Soluzione di lisi delle emazie, da ricostituire con acqua bidistillata sterile Soluzione isotonica, da ricostituire con acqua bidistillata sterile Provette da 0,5 ml, vuote, per biologia molecolare 40 ml 40 ml Idrogeno carbonato di potassio, Cloruro di ammonio, EDTA Cloruro di sodio, TRIS base, TRIS cloridrato Talc Buffer Soluzione di termolisi alcalina 3 ml Idrossido di potassio Resina Resina chelante 3 ml Chelex Neutral Buffer Soluzione di neutralizzazione 3 ml TRIS cloridrato, acido cloridrico GHS05 Pericolo Acqua Ultrapura Acqua per biologia molecolare 9 x 1,9 ml - - SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 1/18 SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 2/18

3 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL KIT - Acqua bidistillata sterile (acqua per preparazioni iniettabili o equivalente). - Cappa a flusso laminare. - Guanti senza polvere monouso in lattice o simili. - Provette in polipropilene sterili da microcentrifuga (1,5 ml). - Miscelatore tipo vortex. - Microcentrifuga da banco ( RPM). - Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Termostato programmabile o termostato a secco a +95 C con blocco per provette da 0,5 ml. ALTRI PRODOTTI RICHIESTI I reagenti per il controllo positivo di estrazione non sono inclusi in questo kit. Per poter eseguire questa procedura analitica si consiglia l impiego del seguente prodotto accessorio di ELITechGroup S.p.A.: «CPE - Internal Control» (codice CTRCPE), una soluzione stabilizzata contenente due DNA plasmidici e RNA genomico di fago MS2 per il Controllo Interno di estrazione ed inibizione per la ricerca degli acidi nucleici in campioni cellulari e non cellulari. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Questo kit è riservato esclusivamente all'uso in vitro. Avvertenze e precauzioni generali Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno 30 minuti oppure trattato in autoclave a 121 C per un'ora prima di essere smaltito. Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere neutralizzati prima dell'eliminazione. Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi o la faccia. Non pipettare a bocca alcuna soluzione. Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro. Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti. Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti. Leggere tutte le istruzioni fornite nel kit prima di eseguire il saggio. Attenersi alle istruzioni fornite nel kit durante l'esecuzione del saggio. Rispettare la data di scadenza del kit. Utilizzare solo i reagenti presenti nel kit e quelli consigliati dal produttore. Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi. Non utilizzare reagenti provenienti da kit di altri produttori. SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 3/18 Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici, richiedono personale competente ed addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni da parte di prodotti di amplificazione. E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Non introdurre mai un prodotto di amplificazione nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Non trasferire mai camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione all'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai essere aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso. Avvertenze e precauzioni specifiche per i componenti Il seguente componente dell contiene reagenti pericolosi. Le frasi di Rischio e Sicurezza della Comunità Europea e le frasi di Pericolo e Precauzioni GHS applicate a questo componente sono elencate qui di seguito. Da notare che l'etichettatura dei rischi non è necessaria se la quantità per flacone è inferiore a 125 g o a 125 ml. Talc Buffer Idrossido di potassio Pericolo GHS05 H314: Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. P260: Non respirare la polvere/i fumi/i gas/la nebbia/i vapori/gli aerosol. P264: Lavare accuratamente le mani dopo l uso.. P280: Indossare guanti/indumenti protettivi/proteggere gli occhi/proteggere il viso. P301+P330+P331: IN CASO DI INGESTIONE: sciacquare la bocca. NON provocare il vomito. P303+P361+P353: IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE (o con i capelli): Togliere gli indumenti contaminati. Sciacquare la pelle/fare una doccia. P304+P340: IN CASO DI INALAZIONE: Trasportare l infortunato all aria aperta e mantenerlo a P305+P351+P338: riposo in posizione che favorisca la respirazione. IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare. P308+P313: In caso di esposizione o di temuta esposizione, consultare un medico. P310: Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico. P321: Trattamento specifico. P363: Lavare gli indumenti contaminati prima di indossarli nuovamente. P405: Conservare sotto chiave. P501: Smaltire il contenuto/recipiente in conformità alla regolamentazione nazionale. SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 4/18

4 CAMPIONI E CONTROLLI PROCEDURE Campioni Con questo kit possono essere utilizzati i seguenti campioni cellulari: - sangue intero (periferico e midollare), vedi pagina 6/18; - leucociti periferici, vedi pagina 7/18; - linfomonociti, vedi pagina 7/18; - granulociti, vedi pagina 7/18; - prelievi cervicali, vedi pagina 7/18; - tamponi uretrali, vedi pagina 7/18; - lavaggio bronco-alveolare, vedi pagina 8/18; - escreato, vedi pagina 8/18; - saliva, vedi pagina 9/18; - gargarizzato, vedi pagina 9/18; - tampone faringeo, vedi pagina 9/18; - tampone nasale, vedi pagina 9/18; - liquido amniotico, vedi pagina 10/18; - urine, vedi pagina 10/18; - liquido cefalorachidiano, vedi pagina 10/18. I campioni devono essere costituiti da cellule eucariote o procariote che possano essere raccolte e concentrate attraverso la centrifugazione. Per gli utilizzatori di saggi di amplificazione quantitativi, per esempio i prodotti tipo "Amplificazione Real Time Duplex" e "Real Time PCR Duplex Monoreagente", si consiglia di prendere sempre nota del numero di cellule presenti nella frazione del campione che sarà processata nelle Microprovette di Estrazione in modo da poter eseguire i calcoli per il dosaggio del parametro in analisi. Le provette in cui si trasferiscono aliquote dei campioni da estrarre devono sempre essere marcate in modo riconoscibile con un pennarello indelebile. Per una conservazione ottimale dei campioni è necessario eseguire le procedure di estrazione a pagina 11/18 o 13/18 fino al punto 3 in modo da ottenere il deposito di cellule nelle Microprovette di Estrazione. In queste condizioni il campione può essere congelato a -20 C per un massimo di trenta giorni o a -70 C per tempi più lunghi. Quando si utilizzano campioni congelati, scongelare i campioni subito prima dell'inizio dell'estrazione per evitare eventuali fenomeni di degradazione degli acidi nucleici. Sostanze interferenti Eparina, mucoproteine o emoglobina sono inibitori degli enzimi DNA polimerasi (per esempio DNA polimerasi termostabili) che possono essere presenti nei campioni di partenza e causare risultati errati nelle fasi successive delle analisi condotte sul DNA estratto. E' necessario che eparina, mucoproteine o emoglobina non siano presenti nel deposito di cellule su cui sarà eseguita l'estrazione del DNA. Per ottenere questo risultato seguire con attenzione le istruzioni fornite nella sezione "Procedure" nei paragrafi dedicati alla preparazione dei singoli campioni e all'estrazione del DNA. Eventuali fenomeni di inibizione da parte di farmaci che possono essere presenti nel campione di partenza andranno valutati di volta in volta sulla base dell'uso che sarà fatto del prodotto di estrazione. Controlli di qualità E' consigliato convalidare l'intera procedura di analisi di ciascuna sessione di estrazione utilizzando un campione negativo e un campione positivo. Come campione negativo, utilizzare un campione negativo già testato per il parametro di interesse oppure eseguire un'estrazione simulata senza alcun campione. Come campione positivo, utilizzare un campione positivo già testato per il parametro di interesse oppure del materiale di riferimento certificato. SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 5/18 Ricostituzione del Lysis Buffer 1x Prima di iniziare la sessione di estrazione dei campioni, ricostituire il Lysis Buffer 1x secondo le seguenti istruzioni. Diluire il Lysis Buffer 10x (40 ml) in una bottiglia sterile con 360 ml di acqua bidistillata sterile in modo da ottenere il Lysis Buffer 1x. Il Lysis Buffer 1x può essere conservato a + 2 / + 8 C per un massimo di sei mesi. Ricostituzione del Cell Buffer 1x Prima di iniziare la sessione di estrazione dei campioni, ricostituire il Cell Buffer 1x secondo le seguenti istruzioni. Diluire il Cell Buffer 10x (40 ml) in una bottiglia sterile con 360 ml di acqua bidistillata sterile in modo da ottenere il Cell Buffer 1x. Il Cell Buffer 1x può essere conservato a + 2 / + 8 C per un massimo di sei mesi. Raccolta, trasporto, conservazione, pretrattamento dei campioni Attenzione: i campioni biologici possono trasmettere agenti infettivi. Preparazione dei campioni di sangue intero (periferico e midollare) I campioni di sangue intero (periferico e midollare) destinati all'estrazione del DNA devono essere raccolti in EDTA secondo le indicazioni del laboratorio, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di tre giorni. Nota bene: Solo nel caso di uso per la ricerca di mutazioni o polimorfismi nel DNA genomico umano, i campioni di sangue intero periferico destinati all'estrazione del DNA possono essere anche congelati e conservati a -20 C per un massimo di trenta giorni. a Trasferire in una provetta in polipropilene sterile da microcentrifuga da 1,5 ml (non fornita nel kit) 100 µl di sangue intero (1 volume), contenente circa leucociti. Nota bene: Nei soggetti normali il sangue intero periferico contiene in media leucociti / µl. Nei casi in cui il valore dell'emocromo del campione fosse minore di leucociti / µl o fosse maggiore di leucociti / µl, il volume di sangue da estrarre e il volume del Lysis Buffer 1x da utilizzare devono essere ricalcolati sulla base del valore dell'emocromo. b Aggiungere 500 µl di Lysis Buffer 1x (5 volumi), miscelare invertendo alcune volte e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. c Centrifugare a temperatura ambiente per 1 minuto a RPM. d Eliminare quanto più possibile il sovranatante prestando attenzione a non asportare il deposito di cellule visibile sul fondo della provetta. e Trasferire 500 µl di Lysis Buffer 1x nella provetta e mescolare su vortex per 15 secondi. f Centrifugare a temperatura ambiente per 1 minuto a RPM. g Eliminare quanto più possibile il sovranatante prestando attenzione a non asportare il deposito di cellule visibile sul fondo della provetta. h Risospendere il deposito di cellule sul fondo della provetta in 500 µl di Cell Buffer 1x. i Procedere come descritto nel paragrafo "Estrazione da sospensioni cellulari" a pagina 11/18. 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5 Preparazione dei campioni di leucociti periferici o di linfomonociti o di granulociti Le sospensioni di leucociti periferici o di linfomonociti o di granulociti destinate all'estrazione del DNA devono essere preparate secondo le indicazioni del laboratorio, risospese in Soluzione fisiologica sterile o PBS sterile, contate e conservate a +2 / +8 C per un massimo di quattro ore. a Trasferire in una provetta in polipropilene sterile da microcentrifuga da 1,5 ml (non fornita nel kit) il volume di sospensione di leucociti periferici o di linfomonociti o di granulociti contenente cellule. b Centrifugare a temperatura ambiente per 30 secondi a RPM. c Eliminare quanto più possibile il sovranatante prestando attenzione a non asportare il deposito di cellule visibile sul fondo della provetta. d Risospendere il deposito di cellule sul fondo della provetta in 500 µl di Cell Buffer 1x. e Procedere come descritto nel paragrafo "Estrazione da sospensioni cellulari" a pagina 11/18. Preparazione dei campioni da prelievi cervicali o da tamponi uretrali Le sospensioni cellulari da prelievi cervicali o da tamponi uretrali destinate all'estrazione del DNA devono essere preparate secondo le indicazioni del laboratorio, risospese in mezzo di trasporto per colture cellulari o Soluzione fisiologica sterile o PBS sterile, trasportate a +2 / +8 C e conservate a +2 / +8 C per un massimo di tre giorni. a Trasferire in una provetta in polipropilene sterile da microcentrifuga da 1,5 ml (non fornita nel kit) fino a 1 ml di sospensione cellulare da prelievi cervicali o da tamponi uretrali. b Centrifugare a temperatura ambiente per 1 minuto a RPM. c Eliminare quanto più possibile il sovranatante prestando attenzione a non asportare il deposito di cellule visibile sul fondo della provetta. Nota bene: Nelle figure in scala 1:1 riportate sotto sono illustrate le dimensioni del deposito di cellule che si ottiene sul fondo della provetta quando sono presenti circa di cellule o circa cellule o circa cellule. Preparazione dei campioni di lavaggio bronco-alveolare o di escreato I campioni di lavaggio bronco-alveolare o di escreato destinati all'estrazione del DNA devono essere raccolti secondo le indicazioni del laboratorio in Soluzione fisiologica sterile, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di tre giorni. a b c d e f g h Trasferire in un tubo in polipropilene sterile da 15 ml (non fornito nel kit) fino a 5 ml di lavaggio broncoalveolare o di escreato. Trasferire nel tubo 1 / 20 di volume (50 µl per ogni ml di campione) di una soluzione 1 M di Ditiotreitolo (DTT, per esempio il prodotto Fluka codice 43816) e mescolarlo con il campione per inversione. In alternativa, trasferire nel tubo un ugual volume di fluidificante mucolitico a base di N-acetil cisteina (10 g di N-acetil cisteina in 100 ml di Soluzione fisiologica sterile, per esempio il prodotto "FLUIMUCIL Fiale" della Zambon Italia) e mescolarlo con il campione invertendo. Mescolare su vortex per 15 secondi e incubare a + 2 / + 8 C per 10 minuti. Mescolare su vortex per 15 secondi e centrifugare a temperatura ambiente per 15 minuti a RPM. Eliminare quanto più possibile il sovranatante, compreso l'eventuale deposito di particelle mucose, prestando attenzione a non asportare il deposito di cellule presente sul fondo del tubo. Trasferire nel tubo 5 ml di Cell Buffer 1x e mescolare per inversione. Mescolare su vortex per 15 secondi e centrifugare a temperatura ambiente per 15 minuti a RPM. Eliminare quanto più possibile il sovranatante, compreso l'eventuale deposito di particelle mucose, prestando attenzione a non asportare il deposito di cellule presente sul fondo del tubo. Nota bene: Nelle figure in scala 1:1 riportate sotto sono illustrate le dimensioni del deposito di cellule che si ottiene sul fondo del tubo quando sono presenti circa di cellule o circa di cellule o circa cellule. ~ di cellule ~ cellule ~ cellule ~ di cellule ~ di cellule ~ cellule d Risospendere il deposito di cellule sul fondo della provetta come descritto di seguito: - se il deposito è di circa di cellule utilizzare un volume di 1 ml di Cell Buffer 1x; - se il deposito è di circa cellule utilizzare un volume di 500 µl di Cell Buffer 1x; - se il deposito è di circa cellule o inferiore utilizzare un volume di 250 µl di Cell Buffer 1x; e Procedere come descritto nel paragrafo "Estrazione da sospensioni cellulari" a pagina 11/18. i Risospendere il deposito di cellule sul fondo del tubo come descritto di seguito: - se il deposito è di circa di cellule utilizzare un volume di 2 ml di Cell Buffer 1x; - se il deposito è di circa di cellule utilizzare un volume di 1 ml di Cell Buffer 1x; - se il deposito è di circa cellule o inferiore utilizzare un volume di 500 µl di Cell Buffer 1x; l Procedere come descritto nel paragrafo "Estrazione da sospensioni cellulari" a pagina 11/18. SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 7/18 SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 8/18

6 Preparazione dei campioni di saliva o di gargarizzato I campioni di saliva o di gargarizzato destinati all'estrazione del DNA devono essere raccolti secondo le indicazioni del laboratorio, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di tre giorni. a Trasferire in una provetta in polipropilene sterile da microcentrifuga da 1,5 ml (non fornita nel kit) 1 ml di saliva o di gargarizzato. b Centrifugare a temperatura ambiente per 1 minuto a RPM. c Eliminare quanto più possibile il sovranatante prestando attenzione a non asportare il deposito di cellule presente sul fondo del tubo. d Trasferire nel tubo 1 ml di Cell Buffer 1x e mescolare per inversione. e Mescolare su vortex per 15 secondi e centrifugare a temperatura ambiente per 1 minuto a RPM. f Eliminare quanto più possibile il sovranatante prestando attenzione a non asportare il deposito di cellule presente sul fondo del tubo. g Risospendere il deposito di cellule sul fondo della provetta in 500 µl di Cell Buffer 1x. h Procedere come descritto nel paragrafo "Estrazione da sospensioni cellulari" a pagina 11/18. Preparazione dei campioni da tampone faringeo o da tampone nasale Le sospensioni cellulari da tampone faringeo o da tampone nasale destinate all'estrazione del DNA devono essere preparate secondo le indicazioni del laboratorio, risospese in mezzo di trasporto per colture cellulari o Soluzione fisiologica sterile o PBS sterile, trasportate a +2 / +8 C e conservate a +2 / +8 C per un massimo di tre giorni. a Trasferire in una provetta in polipropilene sterile da microcentrifuga da 1,5 ml (non fornita nel kit) fino a 1 ml di sospensione cellulare da tampone faringeo o tampone nasale. b Centrifugare a temperatura ambiente per 1 minuto a RPM. c Eliminare quanto più possibile il sovranatante, compreso l'eventuale deposito di particelle mucose, prestando attenzione a non asportare il deposito di cellule visibile sul fondo della provetta. d Risospendere il deposito di cellule sul fondo della provetta in 500 µl di Cell Buffer 1x. e Procedere come descritto nel paragrafo "Estrazione da sospensioni a basso numero di cellule" a pagina 13/18. Preparazione dei campioni di liquido amniotico I campioni di liquido amniotico destinati all'estrazione del DNA devono essere raccolti evitando la contaminazione con il sangue materno secondo le indicazioni del laboratorio, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di tre giorni. a Trasferire in un tubo in polipropilene sterile da 15 ml (non fornito nel kit) 10 ml di liquido amniotico. b Centrifugare a temperatura ambiente per 15 minuti a RPM. c Eliminare quanto più possibile il sovranatante prestando attenzione a non asportare il deposito di cellule presente sul fondo del tubo. d Risospendere il deposito di cellule sul fondo del tubo in 500 µl di Cell Buffer 1x. e Procedere come descritto nel paragrafo "Estrazione da sospensioni a basso numero di cellule" a pagina 13/18. Preparazione dei campioni di urina I campioni di urina destinati all'estrazione del DNA devono essere raccolti in contenitori senza conservanti secondo le indicazioni del laboratorio, trasportati a temperatura ambiente (+ 18 / + 25 C) e conservati a temperatura ambiente (+ 18 / + 25 C) per un massimo di quattro ore. Nota bene: Il trasporto e la conservazione a + 2 / + 8 C causano spesso la formazione di precipitati che possono interferire con le fasi successive della metodica. a Trasferire in un tubo in polipropilene sterile da 15 ml (non fornito nel kit) 10 ml di urina. b Centrifugare a temperatura ambiente per 15 minuti a RPM. c Eliminare quanto più possibile il sovranatante prestando attenzione a non asportare il deposito di cellule presente sul fondo del tubo. d Risospendere il deposito di cellule sul fondo del tubo in 500 µl di Cell Buffer 1x. e Procedere come descritto nel paragrafo "Estrazione da sospensioni a basso numero di cellule" a pagina 13/18. Preparazione dei campioni di liquido cefalorachidiano I campioni di liquido cefalorachidiano destinati all'estrazione del DNA devono essere raccolti secondo le indicazioni del laboratorio evitando la contaminazione con il sangue del paziente, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di quattro ore. I campioni di liquido cefalorachidiano non necessitano di un pretrattamento e possono essere utilizzati direttamente per l'estrazione come descritto nel paragrafo "Estrazione da sospensioni a basso numero di cellule" a pagina 13/18. SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 9/18 SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 10/18

7 Allestimento dell'estrazione Prima di iniziare la sessione è necessario: - impostare il termostato programmabile (thermal - cycler) con blocco termico per provette da 0,5 ml o il termostato a secco con blocco a fori conici per provette da 0,5 ml a +95 C e attendere che raggiunga la temperatura di lavoro; - prelevare una Microprovetta di Estrazione per ciascuno dei campioni da analizzare, una per il controllo positivo e una per il controllo negativo, marcarle in modo riconoscibile con un pennarello indelebile; - controllare che la Resina, lasciata sedimentare, presenti circa metà volume di acqua sopra metà volume di resina. Se il volume di acqua fosse inferiore o la resina fosse a secco aggiungere acqua bidistillata sterile (non fornita nel kit) fino a ripristinare le condizioni descritte prima. Per evitare il disseccamento della resina dopo il primo utilizzo si consiglia di chiudere bene la bottiglia e sigillare con della pellicola tipo Parafilm (non fornita nel kit). Estrazione da sospensioni cellulari 1. Trasferire fino a 500 µl della sospensione cellulare nella Microprovetta di Estrazione da 0,5 ml. 2. Centrifugare a temperatura ambiente per 1 minuto a RPM. 3. Eliminare quanto più possibile il sovranatante prestando attenzione a non asportare il deposito di cellule visibile sul fondo della microprovetta. Nota bene: Se il deposito di cellule presentasse un colore bruno dovuto ad una forte contaminazione da emazie, procedere come descritto di seguito: a Trasferire 100 µl di Lysis Buffer 1x nella microprovetta. b Risospendere il deposito di cellule nel Lysis Buffer 1x. c Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. d Aggiungere 300 µl di Cell Buffer 1x e mescolare delicatamente. e Centrifugare a temperatura ambiente per 1 minuto a RPM. f Eliminare quanto più possibile il sovranatante prestando attenzione a non asportare il deposito di cellule visibile sul fondo della microprovetta. g Riprendere la procedura di estrazione del deposito di cellule dal punto Trasferire 35 µl di Talc Buffer nella microprovetta (Attenzione: il Talc Buffer è classificato come IRRITANTE). 5. Mescolare energicamente il deposito di cellule e il Talc Buffer nella microprovetta. Nota bene: Evitare di produrre schizzi sul tappo della microprovetta. 6. Sistemare la microprovetta nel blocco termico (Attenzione: il blocco termico è caldo) e incubare per 5 minuti a +95 C. 7. Agitare energicamente la Resina e trasferire 35 µl di Resina risospesa nella microprovetta. 8. Mescolare energicamente il lisato cellulare e la Resina nella microprovetta. Nota bene: Evitare di produrre schizzi sul tappo della microprovetta. 9. Sistemare la microprovetta nel blocco termico (Attenzione: il blocco termico è caldo) e incubare per 10 minuti a +95 C. 10. Trasferire 35 µl di Neutral Buffer e mescolare energicamente il contenuto della microprovetta. 11. Centrifugare a temperatura ambiente per 5 minuti a RPM. 12. Scegliere la modalità di utilizzo appropriata come illustrato nella tabella seguente: Il prodotto di estrazione sarà utilizzato in associazione con i prodotti ELITechGroup S.p.A.: serie «AMPLIFICAZIONE SINGLE ROUND» serie «AMPLIFICAZIONE NESTED» serie «AMPLIFICAZIONE REAL TIME DUPLEX» serie «DETERMINAZIONE ALLELICA» serie «REAL TIME PCR DUPLEX MONOREAGENTE» Modalità d'uso del prodotto dell'estrazione utilizzare direttamente il prodotto di estrazione aggiungere al prodotto di estrazione 300 µl di Acqua ultrapura e portarlo a circa 400 µl finali. Nota bene: Il prodotto dell'estrazione è costituito dalla fase acquosa. Al momento di prelevare il prodotto dell'estrazione per allestire la reazione di amplificazione fare attenzione ad aspirare nel puntale SOLO la fase acquosa. NON aspirare nel puntale la Resina presente sul fondo della microprovetta, potrebbe inibire le successive reazioni con gli enzimi DNA polimerasi (per esempio DNA polimerasi termostabili). Nota bene: Il prodotto dell'estrazione può essere conservato a -20 C per un massimo di trenta giorni o a -70 C per periodi più lunghi. Quando si scongela una microprovetta mescolare energicamente e centrifugare a temperatura ambiente per 5 minuti a RPM per separare nuovamente la fase acquosa dalla Resina. Nota bene: Il prodotto dell'estrazione è in grado di contaminare i saggi successivi. Confinare o smaltire in modo appropriato il prodotto dell'estrazione residuo e gli scarti prodotti nelle manipolazioni successive. SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 11/18 SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 12/18

8 Estrazione da sospensioni a basso numero di cellule 1. Trasferire 500 µl della sospensione cellulare nella Microprovetta di Estrazione da 0,5 ml. 2. Centrifugare a temperatura ambiente per 10 minuti a RPM. 3. Eliminare quanto più possibile il sovranatante prestando attenzione a non asportare il deposito di cellule presente sul fondo della microprovetta. Nota bene: Il deposito di cellule di solito è molto piccolo o addirittura non visibile. 4. Trasferire 15 µl di Talc Buffer nella microprovetta (Attenzione: il Talc Buffer è classificato come IRRITANTE). 5. Mescolare energicamente il deposito di cellule e il Talc Buffer nella microprovetta. Nota bene: Evitare di produrre schizzi sul tappo della microprovetta. 6. Sistemare la microprovetta nel blocco termico (Attenzione: il blocco termico è caldo) e incubare per 5 minuti a +95 C. 7. Agitare energicamente la Resina e trasferire 15 µl di Resina risospesa nella microprovetta. 8. Mescolare energicamente il lisato cellulare e la Resina nella microprovetta. Nota bene: Evitare di produrre schizzi sul tappo della microprovetta. 9. Sistemare la microprovetta nel blocco termico (Attenzione: il blocco termico è caldo) e incubare per 10 minuti a +95 C. 10. Trasferire 15 µl di Neutral Buffer nella microprovetta. 11. Aggiungere 5 µl di «CPE - Internal Control» e mescolare energicamente il contenuto della microprovetta. Nota bene: Il «CPE - Internal Control» è necessario per il controllo interno di inibizione dei prodotti ELITechGroup S.p.A. quando il DNA è estratto da campioni che presentano un basso numero di cellule. 12. Centrifugare a temperatura ambiente per 5 minuti a RPM. 13. Scegliere la modalità di utilizzo appropriata come illustrato nella tabella seguente: Il prodotto di estrazione sarà utilizzato in associazione con i prodotti ELITechGroup S.p.A.: serie «AMPLIFICAZIONE SINGLE ROUND» serie «AMPLIFICAZIONE NESTED» serie «AMPLIFICAZIONE REAL TIME DUPLEX» serie «REAL TIME PCR DUPLEX MONOREAGENTE» Modalità d'uso del prodotto dell'estrazione utilizzare direttamente il prodotto di estrazione aggiungere al prodotto di estrazione 150 µl di Acqua ultrapura e portarlo a circa 200 µl finali. Nota bene: Il prodotto dell'estrazione è costituito dalla fase acquosa. Al momento di prelevare il prodotto dell'estrazione per allestire la reazione di amplificazione fare attenzione ad aspirare nel puntale SOLO la fase acquosa. NON aspirare nel puntale la Resina presente sul fondo della microprovetta, potrebbe inibire le successive reazioni con gli enzimi DNA polimerasi (per esempio DNA polimerasi termostabili). Nota bene: Il prodotto dell'estrazione può essere conservato a -20 C per un massimo di trenta giorni o a -70 C per periodi più lunghi. Quando si scongela una microprovetta mescolare energicamente e centrifugare a temperatura ambiente per 5 minuti a RPM per separare nuovamente la fase acquosa dalla Resina. Nota bene: Il prodotto dell'estrazione è in grado di contaminare i saggi successivi. Confinare o smaltire in modo appropriato il prodotto dell'estrazione residuo e gli scarti prodotti nelle manipolazioni successive. LIMITI DELLA PROCEDURA Utilizzare con questo prodotto soltanto i seguenti campioni umani: sangue intero (periferico e midollare), leucociti periferici, linfomonociti, granulociti, prelievi cervicali, tamponi uretrali, tamponi faringei, tamponi nasali, lavaggio bronco-alveolare, escreato, saliva, gargarizzato, liquido amniotico, urine e liquido cefalorachidiano. E' necessario che eparina, mucoproteine o emoglobina non siano presenti nel deposito di cellule su cui sarà eseguita l'estrazione del DNA. Per ottenere questo risultato seguire con attenzione le istruzioni fornite. Non eseguire l'estrazione del DNA con questo prodotto su depositi di cellule contenenti eparina: l'eparina inibisce gli enzimi DNA polimerasi (per esempio DNA polimerasi termostabili) e causa risultati non validi o errati nelle fasi successive delle analisi condotte sul DNA estratto. Non eseguire l'estrazione del DNA con questo prodotto su depositi di cellule contenenti mucoproteine o emoglobina: le mucoproteine e l'emoglobina possono inibire gli enzimi DNA polimerasi (per esempio DNA polimerasi termostabili) e causare risultati non validi o errati nelle fasi successive delle analisi condotte sul DNA estratto. Eventuali fenomeni di inibizione da parte di farmaci che possono essere presenti nel campione di partenza andranno valutati di volta in volta sulla base dell'uso che sarà fatto del prodotto di estrazione. I risultati ottenuti con questo prodotto dipendono dalla corretta identificazione, raccolta, trasporto, conservazione e preparazione dei campioni; per evitare risultati errati è quindi necessario porre particolare cura durante queste fasi e seguire attentamente le istruzioni fornite. Questo prodotto richiede personale competente ed addestrato alla manipolazione di campioni biologici in grado di trasmettere agenti infettivi e di preparati chimici classificati pericolosi per evitare incidenti con conseguenze potenzialmente gravi per l'utilizzatore o altre persone. Questo prodotto richiede indumenti di lavoro e aree di lavoro adeguate alla manipolazione di campioni biologici in grado di trasmettere agenti infettivi e di preparati chimici classificati pericolosi per evitare incidenti con conseguenze potenzialmente gravi per l'utilizzatore o altre persone. Questo prodotto richiede personale addestrato per le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici per evitare risultati errati nelle fasi successive delle analisi condotte sul DNA estratto con conseguenze potenzialmente gravi per il paziente. Questo prodotto richiede aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione per evitare risultati falsi positivi nelle fasi successive delle analisi condotte sul DNA estratto con conseguenze potenzialmente gravi per il paziente. Questo prodotto richiede indumenti di lavoro e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione per evitare risultati falsi positivi nelle fasi successive delle analisi condotte sul DNA estratto con conseguenze potenzialmente gravi per il paziente. SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 13/18 SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 14/18

9 Efficienza di estrazione CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI Questo sistema di estrazione permette di utilizzare fino a cellule del campione in analisi e di rendere disponibile circa il 100% del DNA presente in partenza nelle cellule stesse. L'efficienza della metodica di estrazione per lisi alcalina ad alta temperatura, come capacità di rendere disponibile il DNA del campione, è attestata dalla letteratura (vedi al paragrafo successivo "Bibliografia") ed è stata verificata nelle validazioni dei prodotti ELITechGroup S.p.A. utilizzando campioni clinici positivi per Aspergillus spp., Chlamydia trachomatis, Legionella pneumophila, Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, CMV, EBV, HHV6, HHV8. A titolo di esempio si riportano alcuni dati relativi alla Chlamydia trachomatis. Le prove sono state eseguite utilizzando come materiale di riferimento certificato un pannello di diluizioni di Chlamydia trachomatis (QCMD 2008 Chlamydia trachomatis Proficiency Panel, QCMD, Scotland, UK). Ciascun campione del pannello è stato impiegato in 2 replicati per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione e amplificazione, con i prodotti ELITechGroup S.p.A. e gli accessori. La disponibilità del DNA bersaglio è stata valutata attraverso la determinazione del Ciclo soglia (Cycle threshold, Ct) della reazione che dipende dalle copie del plasmide endogeno di Chlamydia trachomatis presenti nella reazione. I risultati finali sono riportati nella tabella seguente. Prove con materiale di riferimento certificato Campione Patogeno, matrice Risultato atteso Positivi / replicati Media Ct CTB08-01 C. trachomatis, urine forte positivo 2 / 2 34,08 CTB08-02 C. trachomatis, urine forte positivo 2 / 2 30,17 CTB08-03 C. trachomatis, urine debole positivo 2 / 2 38,41 CTB08-04 negativo, urine negativo 0 / 2 non rivelato CTB08-05 C. trachomatis e N. gonorreae, urine debole positivo 2 / 2 37,06 CTB08-06 C. trachomatis, urine positivo 2 / 2 33,95 CTB08-07 C. trachomatis (ceppo svedese), urine debole positivo 2 / 2 19,23 CTB08-08 C. trachomatis, tampone positivo 2 / 2 39,35 CTB08-09 C. trachomatis, tampone forte positivo 2 / 2 32,35 CTB08-10 negativo, tampone negativo 0 / 2 non rivelato Tutti i campioni sono stati identificati correttamente: il campione CTB08-07 è un forte positivo per il ceppo svedese di C. trachomatis che è stato rivelato senza problemi dal prodotto di amplificazione di ELITechGroup S.p.A. La ripetibilità dei risultati del sistema di estrazione, come paragone di più replicati in una stessa sessione, è stata verificata utilizzando un campione di sangue periferico raccolto in EDTA. Le prove sono state eseguite utilizzando come materiale di riferimento un campione di sangue periferico raccolto in EDTA contenente circa leucociti / µl. Il campione è stato impiegato in 10 aliquote, ciascuno contenente circa di leucociti, per eseguire la procedura di estrazione in condizioni di stress da eccesso di cellule. Ciascun prodotto di estrazione è stato analizzato in 3 replicati con un sistema di amplificazione real time (prodotti ELITechGroup S.p.A.). La disponibilità del DNA genomico è stata valutata attraverso la determinazione del Ciclo soglia (Cycle threshold, Ct) della reazione che dipende dalle copie del gene umano codificante la beta Globina presenti nella reazione. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Aliquota Replicati Ct medio Deviazione standard CV% ,53 0,18 0, ,14 0,13 0, ,03 0,10 0, ,10 0,07 0, ,22 0,06 0, ,14 0,04 0, ,58 0,09 0, ,36 0,13 0, ,42 0,19 0, ,60 0,14 0,59 I valori calcolati su tutte e 30 le analisi sono i seguenti: Campione Replicati Ct medio Deviazione standard CV% 2 x 10 6 leucociti 30 23,31 0,23 0,99 Nota bene: I dati e i risultati completi delle prove eseguite per la valutazione delle caratteristiche delle prestazioni del prodotto sono registrati nella Sezione 7 del Fascicolo Tecnico di Prodotto "", FTP. BIBLIOGRAFIA Rolfs, A et al. (1992) PCR: clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin. Capitolo 7, pag e SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 15/18 SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 16/18

10 PROBLEMI E SOLUZIONI LEGENDA DEI SIMBOLI Falsi negativi Possibili cause Soluzioni Numero di catalogo. Degradazione dell'acido nucleico del campione. Perdita del deposito di cellule. Utilizzare un nuovo campione, conservare nel modo adatto i campioni. Dopo le centrifugazioni, aspirare con attenzione il sovranatante per non rimuovere il deposito di cellule. Limiti di temperatura. Deposito di cellule fortemente contaminato da emazie. Eseguire il trattamento aggiuntivo di lisi delle emazie. Codice del lotto. Estrazione non efficiente. Dispensazione errata dei reagenti di estrazione. Trasferimento della Resina nella reazione di amplificazione. Evitare che il campione si sposti sul tappo della microprovetta durante l'estrazione, controllare che il termostato sia a +95 C, rispettare i tempi di incubazione a +95 C, controllare che i fori del blocco termico siano adatti ad ospitare le microprovette. Dispensare con attenzione i volumi (uguali tra loro) di Talc Buffer, Resina e Neutral Buffer. Prelevare con attenzione solo la fase acquosa dalla microprovetta di estrazione. Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese). Dispositivo medico diagnostico in vitro. Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici diagnostici in vitro. Degradazione dell'acido nucleico estratto. Utilizzare plastica esente da DNasi. Contenuto sufficiente per "N" test. Falsi positivi Possibili cause Soluzioni CONT Contenuti. Contaminazione durante l'estrazione dei campioni. Aprire una provetta per volta, evitare di spargere il contenuto della provetta, cambiare sempre puntale tra un campione e l'altro, evitare che il campione si sposti sul tappo della microprovetta durante l'estrazione. Attenzione, consultare le istruzioni per l uso. Contaminazione dell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. Pulire superfici e strumenti con detergenti acquosi, lavare camici, sostituire provette e puntali in uso. Fabbricante. SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 17/18 SCH m 18/06/15 Revisione 04 Pag. 18/18