a) DENATURAZIONE b) APPAIAMENTO c) SINTESI

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1 La PCR è una tecnica biomolecolare messa a punto da Mullis et al. (1986) che perme6e l amplificazione esponenziale in vitro di sequenze di acidi nucleici. La reazione di PCR illustrata in figura prevede le seguend fasi (Innis et al., 1990): a) DENATURAZIONE b) APPAIAMENTO c) SINTESI

2 Denaturazione: Il ds DNA (DNA a doppio filamento) viene denaturato ad una temperatura di circa 95 C e viene converito in ss DNA (DNA a singolo filamento). Appaiamento: I primer oligonucleoidici, complementari alle due estremita 3 della sequenza da amplificare, ibridano con i due filameni denaturai ad una T di circa 5 C più bassa della Tm dei primers stessi. La loro sequenza è orientata in modo da guidare la polimerizzazione del DNA in direzione 5 nel traro tra le regioni a cui essi si associano. Estensione o sintesi del DNA: In genere avviene ad una temperatura di circa 70 C (CHE DIPENDE DALL ENZIMA) in presenza dei quarro dideossinucleoidi trifosfai e di una DNA polimerasi. Il ciclo può essere ripetuto anche fino a cinquanta volte portando ad un numero di copie amplificate pari a: 2(n 2).

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4 Il primo ciclo dà come risultato due nuovi filameni di DNA la cui estremità 5 è fissata dalla posizione del primer oligonucleoidico mentre l estremità 3 è variabile. I due filameni servono a loro volta da stampi per la sintesi di filameni complementari di lunghezza desiderata. Dopo pochi cicli di PCR il prodoro di lunghezza fissa desiderata comincia a predominare su quelli di lunghezza variabile (Fig. 6) (Strachan & Read, 2001).

5 Templato: I risultai migliori si orengono con frammeni non superiori a 1,5 kb. Il numero di cicli non deve superare la quaranina, poiché dopo un certo numero, l amplificazione non è più esponenziale ma raggiunge un plateau dovuto o alla carenza di oligonucleoidi e di dntps, o all'aumento di PPi, o all'eventuale comparsa di DNA parassita amplificato. La purezza e il materiale di partenza sono condizioni limitani: in generale bisogna evitare tub i contaminani chimici che non permerano un abvità polimerasica efficace. Alla fine dell estrazione è necessario eliminare ture le sostanze che potrebbero interferire con l abvità enzimaica: l'edta, che chela il Mg2+ indispensabile per le polimerasi e gli acidi fori e i sali, che potrebbero formare complessi nel sito abvo dell enzima e inibirlo.

6 Precursori (dntps): Devono essere bilanciai, perché se ce n è uno in concentrazione limitante l enzima o incorpora qualcos altro o si ferma. Oligonucleo9di: Devono essere lunghi tra le 15 e le 30bp, con una percentuale di CG all'incirca pari al 50%. Per evitare problemi, i primers dovrebbero essere purificai mediante HPLC a scambio ionico. La concentrazione obmale dev'essere determinata empiricamente, ma in genere varia da 0,1 a 1μM; una scarsa quanità di primers porta ad un prodoro di amplificazione basso o inesistente, mentre se questa è eccessiva, porta all'amplificazione di sequenze non specifiche. La coppia di oligo deve avere temperature di denaturazione simili (Tm1~Tm2).

7 Scelta della Tm: Più la Tm (temperatura di fusione per la denaturazione del DNA) è alta, più aumenta la probabilità che gli oligo si appaino specificatamente. La Tm si calcola con una formula empirica, che Iene conto del contributo alla stabilità delle GC e delle AT dei primers: Tm = 4 x ngc + 2 x nat Affinchè l effebva concentrazione di oligonucleoidi nella miscela di reazione non si abbassi, riducendo notevolmente l efficienza dell amplificazione, non deve verificarsi "self annealing": quindi gli oligo non devono appaiarsi fra loro (in paricolare, in corrispondenza del 3 dove ha inizio il processo di polimerizzazione). Questo infab causerebbe la formazione di piccole molecole di circa 100 bp, orenute ad ogni ciclo di PCR dalla sequenza in tandem.

8 Organizzazione del genoma umano % genoma nucleare coniene la stragrande maggioranza delle informazioni è stato simato contenere geni 0,0005 % genoma mitocondriale coniene i geni ribosomali e alcuni geni che producono mrna tradob nel mitocondrio stesso (in totale 37)

9 Genoma nucleare Genoma mitocondriale 1.5% ~3% ~5% <2% ~44% ~45% ~93% ~6.6% Altamente conservato, codificante Altamente conservato, altro Ripetizioni derivanti da trasposizione Eterocromatina Altro non conservato

10 Differenze tra DNA mitocondriale e nucleare ~ ?