Protocollo di Real-Time RT-PCR per la diagnosi del fitoplasma della Moria del Pero. Claudio Ratti, Chiara Lanzoni e Carlo Poggi Pollini

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1 Protocollo di Real-Time RT-PCR per la diagnosi del fitoplasma della Moria del Pero Claudio Ratti, Chiara Lanzoni e Carlo Poggi Pollini

2 Moria del pero (Candidatus Phytoplasma pyri) Fitoplasmi: Microrganismi procarioti unicellulari che, a differenza dei batteri, non possiedono pareti cellulari e che si possono sviluppare esclusivamente su tessuto vivo d un ospite. Genoma a DNA: cromosoma relativamente piccolo ( kbp) Genoma virale: 1,8-350 kbp E. coli: kbp

3 - Diagnosi molecolare Basata sulla sintesi della catena complementare di DNA ad opera di un enzima (la polimerasi) in una reazione a catena (PCR = polymerase chain reaction) A. Kronembreg e coll. (Stanford University) Scoperta della DNA-polimerasi cellulare primers DNA polimerasi DNA da amplificare

4 DNA polimerasi primer Nucleotide (dntp)

5 1983 Kary.B. Mullis utilizzò la DNA polimerasi in una reazione di polimerizzazione ciclica: la PCR Premio Nobel per la Chimica nel LEGAME DEI PRIMERS DI INNESCO APERTURA DOPPIA ELICA DEL DNA DUPLICAZIONE DEL DNA STAMPO

6 IL MECCANISMO DELLA PCR: GLI STEP DELLA PCR: 1) Denaturazione a 94 C 2) Appaiamento dei primers a C 3) Estensione a 72 C

7 Amplificazione esponenziale Per una PCR di 35 cicli: 34 miliardi di copie

8 ELEMENTI NECESSARI PER LA REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE Primers DNA polimerasi Desossi Nucleotidi trifosfati (dntp) Base Azotata (Adenina, Timina, Citosina, Guanina, Uracile) DNA STAMPO DESOSSIRIBOSIO

9 LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI GLI «INGREDIENTI» FONDAMENTALI DELLA PCR: Primers: (POLIMERASE CHAIN REACTION) corte sequenze di DNA complementari alle 2 estremità del framento da amplificare dntps (datp,dgtp,dctp,dttp): nucleotidi trifosfati, mattoni per costruire i nuovi filamenti Taq polimerasi (buffer, MgCl2): enzima (DNA polimerasi) che compie la reazione DNA stampo: Squenza bersaglio

10 PCR (reazione a catena della polimerasi)

11 Per i virus il cui genoma è costituito da RNA, si utilizza la trascrittasi inversa, che consente la sintesi di un primo filamento di DNA (cdna) sul quale si innesca la reazione a catena della polimerasi Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

12 Bassa concentrazione del Fitoplasma nella pianta: NESTED PCR (npcr) aumento della sensibilità, riduzione degli inibitori DNA TARGET - Primo step: Primers Esterni Secondo Step: Primers Interni I AMPLIFICATO II AMPLIFICATO RIVELAZIONE ED ANALISI DEL PRODOTTO DI AMPLIFICAZIONE

13 Nested-PCR Tecnica molto sensibile ma può presentare diverse limitazioni, in particolare nell esecuzione di saggi su larga scala: molto laboriosa con alto dispendio di tempo; rischio di contaminazioni molto elevato. Multiplex Real-Time PCR

14 Real-Time PCR: Caratteristiche È possibile monitorare in ogni istante la cinetica della reazione di PCR mediante il rilevamento di una fluorescenza Si riesce a misurare l amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati quantitativi molto più accurati rispetto alla PCR tradizione end point.

15 Real-Time PCR: Caratteristiche Rilevamento della fluorescenza associata all amplificazione Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer

16 Bioneer LightCycler Roche LightCycler 480 System Roche iq5 Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 7700 Applied Biosystems Mx4000 Multiplex Quantitative PCR System STRATAGENE Real-time nucleic acid detection system 7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems ABI PRISM 7000 SDS Applied Biosystem Mx3000P QPCR System STRATAGENE

17 Real-Time PCR: Caratteristiche Baseline il segnale di fluorescenza è accumulato ma è al di sotto del limite di rilevazione dello strumento Linea soglia linea che interseca tutte le curve di amplificazione dei campioni all inizio delle fase esponenziale Ciclo soglia (C T ) è la frazione di ciclo in cui la fluorescenza emessa attraversa la linea soglia Il valore che assume è INVERSAMENTE PROPORZIONALE alla quantità iniziale di DNA R n indica la fluorescenza relativa calcolata dal software: Rn f - Rn b

18 Classificazione chimiche di rilevazione Quasi tutti gli attuali sistemi Real Time PCR sono basati sull emissione di un segnale di fluorescenza direttamente proporzionale alla quantità di amplicone formato. Sistemi basati su molecole leganti il doppio filamento di DNA: Etidio Bromuro SYBR Green BOXTO Sistemi basati sull idrolisi di sonde TaqMAN Sistemi basati su primer o sonde marcate: Molecular Beacon Scorpion Primer LUX Primer Simple probe FRET hybridization probes Plexor Technology

19 TaqMAN CARATTERISTICA: presenza sonda. Oligonucleotide di circa bp Ibridazione lungo la sequenza bersaglio Reporter al terminale 5 e Quencher al terminale 3 Il terminale 3 non può essere esteso dalla Taq Polimerasi Temperatura di dissociazione circa 10 C più elevata rispetto alla coppia di primer usati nella reazione

20 TaqMAN Forward primer Taq Taq Polimerasi Probe R Q Reverse primer

21 From PacMan to TaqMan - a computer game revisited The TaqMan process is based on the PacMan principle - a computer game introduced more than twenty years ago.

22 Estrazione degli acidi nucleici Estrarre gli acidi nucleici del fitoplasma + acidi nucleici della pianta dai tessuti vegetali Protocollo CTAB Protocollo SPOT

23 Omogeneizzazione di 1 gr. di nervature con sabbia e tampone Dellaporta (grinding buffer) Centrifugazione a 4000rpm per 5 min a 4 C Centrifugazione del sopranatante a 11000rpm per 25 min a 4 C Protocollo di estrazione CTAB (5 h) Risospensione pellet in tampone di estrazione Doyle & Doyle, trasferimento in tubo Eppendorf e incubazione a 60 C per 30 min. Aggiunta di cloroformio:alcol isoamilico (IAA) (24:1) e centrifuga a 6000rpm per 5 min a RT Precipitazione fase acquosa con 1 vol. di isopropanolo freddo a -80 C per 15 min. Centrifugazione a 13000rpm per 15 min a 4 C Lavaggio del pellet con etanolo 70% e precipitazione con sodio acetato (NaOAc) e etanolo assoluto a -80 C per 10 min. Centrifugazione a 13000rpm per 15 min a 4 C Lavaggio del pellet con etanolo 70% e risospensione con 100μl di acqua distillata sterile trattata con DEPC (dietilpirocarbonato)

24 Macinare 1gr di floema in 5 ml di Tampone di estrazione Caricare 5 ul di ogni campione omogeneizzato su dischetti di nylon e asciugare Protocollo di estrazione SPOT (15-20 min) Aggiungere 100 ul di buffer di risospensione Denaturare10 min a 95 C Centrifugare le strip almeno 2 min. Prelevare 2 ul e aggiungerli alla mix di Real Time.

25 Sonde TaqMAN - PD Sonde e primers specifici per il fitoplasma della Moria del Pero sono stati disegnati su una zona variabile del gene 16S rdna, utilizzando il software Primer Express 2.0 (Applied Biosystem). Controllo endogeno: primers e sonda disegnati sul gene che codifica per la sub-unità 18S. Marcate con due fluorocromi differenti all estremità 5, per poterle usare simultaneamente nella reazione.

26 Real-Time PCR: PCR singola PD 18 S

27 Real-Time PCR: PCR duplex PD + 18S

28 Come ottimizzare la sensibilità della diagnosi Diagnosi classica: amplificazione DNA del Fitoplasma (npcr, Real-Time PCR ) Il Fitoplasma (DNA) ha una bassa concentrazione nella pianta. Il Fitoplasma produce un alto numero di copie di RNA durante la propria moltiplicazione. L RNA è indice di attività metabolica del Fitoplasma Amplificare anche l RNA del Fitoplasma per aumentare la sensibilità della diagnosi

29 DNA vs. RNA in protocollo CTAB

30 DNA vs. RNA in protocollo SPOT

31 RT-PCR vs. PCR in protocollo CTAB

32 RT-PCR vs. PCR in protocollo SPOT

33 Multiplex Real-Time PCR: conclusioni Alta specificità Alta sensibilità Riproducibilità dei risultati

34 Multiplex Real-Time RT-PCR: Sistema chiuso : rischio di contaminazione molto limitato e assenza di falsi positivi Saggi molto rapidi: circa 1/4 del tempo richiesto dai protocolli classici di nested-pcr Presenza del controllo endogeno (18 S) rende il metodo più affidabile: assenza di falsi negativi La SPOT Real-Time RT-PCR risulta la tecnologia ideale da applicare alla diagnosi del fitoplasma della Moria del Pero, in particolare per analisi su larga scala